von escherichia coli ml 30 bei tiefen

Diss. ETH Nr. 8831
KINETIK UND REGULATION DES ZUCKERABBAUS
VON ESCHERICHIA COLI ML 30 BEI TIEFEN
ZUCKERKONZENTRATIONEN
ABHANDLUNG
zur Erlangung des Titels
DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN
der
EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE
ZÜRICH
vorgelegt von
HEINRICH PETER SENN
Dipl. Biol. Universität Basel
geboren am 15. Juli 1952
von Zofingen
(Kanton Aargau)
angenommen auf Antrag von
Prof. Dr. G. Hamer, Referent
Prof. Dr. T. Leisinger, Korreferent
Zürich 1989
Danksagung
Ich möchte meinem Referenten Herrn Prof. G. Hamer für die wissenschaftliche Unterstützung und den gewährten Freiraum herzlich danken.
- Herrn Prof. Th. Leisinger danke ich für die Übernahme des Korreferats.
- Dr. Mario Snozzi danke ich für die kompetente Leitung meiner Arbeit
und die wertvollen Diskussionen.
- Dr. Thomas Egli möchte ich für die Ausarbeitung des Themas sowie
die genaue Durchsicht des Manuskripts danken.
- Gerne erinnere ich mich der Zeit, als Prof. M.K.C. Sridhar mit mir das
Labor teilte.
- Mein Dank gilt auch den Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Labors,
im Speziellen Frau R. Arnold, Thomas Fleischmann und H.U. Weilenmann, sowie allen Doktorandinnen und Doktoranden, die inuner für eine
gute Stinunun g besorgt waren.
- Mein spezieller Dank gilt meinen Eltern und Daniela, die mit ihrer
Liebe und Geduld mir eine feste Stütze waren.
- Herrn Prof. W. Stunun und allen Mitarbeitern der EAW AG danke ich
für die motivierende Stinunw1g innerhalb des Instituts.
INHAL TSVER ZEICHN IS
Kinetik und Regulation des Zuckerab baus von E. coli ML 30 bei tiefen
Zuckerko nzentrati onen
1. Allgemeine Einleitung
1
2. Material und Methoden
2.1 Organismen
2.2 Wachstumsbedingungen
2.3 Bestimmung der Bakteriendichte
2.4 Methode der Spurenanalyse von Zuckern in
komplexen Medien
2.4.1 Bestimmung reduzierender Kohlehydrate
nach Watanabe und Inoue (1983)
2.4.2 Eichkurve und linearer Bereich
2.4.3 Probenahme und Filtration
2.4.4 Entsalzung
2.4.5 Chromatogramme
2.4.6 Isomerisation
12
12
12
14
3. Resultate (Experimente)
3.1 Verhalten des Restsubstrats einer Glucoselimitierten Chemostatkultur von E. coli
a. Einleitung
b. Resultate
c. Diskussion
d. Schlussfolgerung
3.2 Beziehung der Wachstumsrate zur limitierenden
Substratkonzentration: s vs. D - Diagramm einer
Glucose-limitierten Chemostatkultur von E. coli
a. Einleitung
b. Resultate
c. Diskussion
29
14
14
15
19
21
22
26
29
29
31
36
46
48
48
55
64
3.3 Regulation des Zuckerabbaus bei E. coli unter
Kohlenstoff-limitierten Bedingungen
a. Einleitung
b. Resultate
c. Diskussion
3.4 Regulation des Zuckerabbaus bei E. coli unter
Kohlenstoff-gesättigten Bedingungen
a. Einleitung
b. Resultate
c. Diskussion
74
74
75
80
85
85
86
98
4. Abschliessende Diskussion
104
5. Zusammenfassung/Summary
110
6. Literaturverzeichnis
115
1. ALLGEMEINE EINLEITUNG
Die Kohlehydrate besetzen einen wichtigen Platz in der Chemie der Lebensprozesse. Zu den Kohlehydraten zählt man Polyhydroxyaldehyde und
-ketone, die zumeist die Summenformel C0 (H20)0 besitzen. Die einfachsten
Moleküle unter ihnen sind die Monosaccharide, welche intramolekulär stabile
Halbacetale bilden können, wodurch sie befähigt sind, sich mit andern
Monosacchariden glykosidisch zu verbinden. Die Möglichkeit der
Zyklisierung ist gegeben, wenn die Kettenlänge für einen 5- (Furanosid) oder
6-gliedrigen (Pyranosid) Ring ausreicht, d.h. für Monosaccharide mit mehr
als 4 Kohlenstoffatomen. Der Polymerisationsgrad kann recht unterschiedlich
gross sein, was zur Einteilung in Oligo- (2-10 Monosaccharide) und Polysaccharide (> 10 Monosaccharide) führte. Der Sammelbegriff "Zucker" wird
in der Kohlehydratchemie weitgehend vermieden, bezeichnet aber allgemein
Mono- und Disaccharide, die durch den süssen Geschmack charakterisiert
sind. In der Mikrobiologie hat der Begriff Zucker insofern seine Berechtigung, da im Gegensatz zu den höher polymerisierten Fom1en, Zucker für die
Bakterien direkt als Kohlenstoff- und Energiequelle verwertbar sind.
Zucker, in freier oder gebundener Form, sind die am häufigsten vorkommenden organischen Stoffe der Biosphäre. Sie werden als Primärprodukt der
Photosynthese von den grünen Pflanzen gebildet und erfüllen in der
Pflanzenzelle wichtige Funktionen als Bausteine der Reservestoffe und Zellwände. Monosaccharide sind ausserdem am Aufbau einer ganzen Reihe
biologisch wichtiger Moleküle wie RNA, DNA oder Glykolipiden und
-proteinen beteiligt.
In der Natur können ca. 200 verschiedene Polysaccharide unterschieden
werden (Weide 1983). Das bedeutendste unter ihnen ist zweifellos die Cellulose, welche der am häufigsten vorkommende Naturstoff der Biosphäre überhaupt ist. Cellulose besteht aus Ketten ß-glykosidisch verknüpfter Glucosemoleküle mit einem Polymerisationsgrad von ca. 14000. Jährlich werden
etwa 1011 Tonnen Cellulose neu gebildet (Lehmann 1976). a.-Glykosidisch
verknüpfte Glucosemoleküle haben im biologischen Reich eine grosse
Bedeutung als Speichersubstrat. Glykogen spielt im Energiehaushalt von
Bakterien, Pilzen und Tieren eine grosse Rolle, während in den Pflanzen
2
Stärke dominiert. Mit dem reichlichen Vorkommen der Glucose in der Natur
lässt sich auch ihre überragende Bedeutung unter den Zuckern erklären.
In aquatischen Systemen wird organisches Material vor allem in situ
produziert. Als wichtigste Quelle fungieren dabei die photosynthetisch
aktiven Organismen, insbesondere Algen. In den natürlichen Gewässern liegt
der grösste Teil des organischen Kohlenstoffs in "gelöster" Form vor, wobei
unter gelöstem organischen Kohlenstoff (dissolved organic carbon, DOC)
diejenigen kohlenstoffhaltigen Moleküle definiert sind, die einen Filter von
0.45 µm Porengrösse passieren. In marinen Gewässern liegen ca. 80 - 95 %
der gesamten organischen Kohlenstoffverbindungen als DOC vor
(MacKinnon 1981). Je nach Trophiegrad schwankt die DOC-Konzentration
zwischen 0.5 und 10 mg/l, kann aber, bedingt durch terrestrischen Eintrag
(Laubfall, Abschwemmungen von Böden, Abwasserimmissionen usw.) auch
wesentlich höhere Werte erreichen.
Am Abbau der gelösten Kohlenstoffverbindungen sind hauptsächlich Bak-
terien beteiligt (Andrews und Williams 1971), welche diese organischen
Moleküle einerseits für den Aufbau ihres Kohlenstoffsgerüsts, andererseits
als Energiequelle benutzen. Bakterien wie E. coli verwenden die organischen
Kohlenstoffverbindungen sowohl als Kohlenstoff- als auch als Energiequelle.
Trotz den zum Teil hohen Konzentrationen an gelösten organischen Stoffen
in natürlichen Gewässern ist das Wachstum der heterotrophen Bakterien in
der Regel Kohlenstoff-limitiert (Konings und Veldkamp 1981). Dies liegt
daran, dass der für Bakterien unmittelbar verfügbare Anteil stets sehr gering
ist, denn grössere Moleküle können die bakterielle Membran nicht passieren.
Der wachstumslimitierende Schritt ist deshalb die Hydrolyse von grösseren in
kleinere Moleküle. An diesem Prozess sind die Mikroorganismen massgeblich beteiligt, indem sie Enzyme in die Umgebung ausscheiden (Exoenzyme),
die den Hydrolyseschritt katalysieren. Ein bekanntes Beispiel dafür sind die
Cellulasen, welche Cellulose in kleinere Moleküle und schliesslich in Cellobiose zerlegen; letztere wird dann entweder direkt aufgenommen oder durch
die ß-Glucosidase in zwei Moleküle Glucose gespalten.
Die Bedeutung der freien Zucker als Kohlenstoff- und Energiequelle für
heterotrophe Bakterien ist ausserordentlich gross; schon in kleinen Konzentrationen stellen sie für heterotrophe Bakterien eine substantielle Nährstoffbasis dar (Dawson und Liebezeit 1981). Der wichtigste Zucker in aquatischen
Systemen ist zweifellos die Glucose, welcher auch der mit Abstand am besten
3
untersuchte Zucker in natürlichen Gewässern ist. In Tabelle 1.1 sind einige
Glucosekonzentrationen aus der Literatur zusammengestellt.
Tab. 1.1 Glucosekonzentrationen in natürlichen Gewässern
Autoren
Degens et al. 1964
Hicks & Carey 1968
Vaccaro et al. 1968
Hanson & Snyder 1979
Andrews & Williams 1971
Mopper 1977
Mopper et al. 1980
Gocke et al. 1981
Glucose (µg/l)
5.4 - 15.5
3.6 - 10.8
5 - 195
24- 34
< 1 - 5.7
4.5 - 53.5
5.7 - 120
10 - 19.2
Methode
Papierchromatographie
Hexokinase/G6P-Dehydr.
Hexokinase/G6P-Dehydr.
Hexokinase/G6P-Dehydr.
Glucose-Oxidase
Konz. +HPLC
Konz.+HPLC
Konz. +HPLC
Die meisten Werte aus Tabelle 1.1 stammen aus Meerwasserproben, während
entsprechende Messungen aus Binnengewässern fast vollständig fehlen. Aus
der Tabelle geht hervor, dass grosse Unterschiede in den
Glucosekonzentrationen existieren. Der durchschnittliche Minimalwert liegt
bei etwa 5 µg/l, während der Maximalwert bis gegen 200 µg/l steigen kann.
Der Grund für diese Unterschiede ist nicht bekannt, und eine Abhängigkeit
der Glucosekonzentration vom Trophiegrad der Gewässer scheint nicht zu
bestehen (Gocke et al. 1981). Zur Bestimmung der Glucose hat sich das
kombinierte Enzymsystem, bestehend aus der Hexokinase und der Glucose6-Phosphat Dehydrogenase, mit fluorimetrischer Detektion des gebildeten
NADH bewährt. Sie wurde erstmals von Hicks und Carey (1968) auf
natürliche Gewässer angewandt. Die Methode hat den Nachteil, dass sie sehr
arbeitsaufwendig ist (Hanson und Snyder 1979) und nur die Glucose erfassen
kann. Die Arbeitsgruppe um Mopper wandten eine Methode an, mit der sich
alle reduzierenden Kohlehydrate bestimmen lassen (Mopper 1978 a, b); dabei
werden die Zucker mittels HPLC getrennt und anschliessend, nach Reaktion
mit einer Cu2+-Lösung, spektrophotometrisch detektiert. Die Methode ist
jedoch nicht sehr sensitiv, sodass die Proben vor der Auftrennung
aufkonzentriert werden müssen. Die Bedeutung anderer Zucker, insbesondere
der Fructose, in natürlichen Gewässern konnten Mopper et al. (1980) zeigen;
sie fanden in mehr als 150 Meerwasser- und Sedimentwasserproben
4
Fructosekonzentrationen, die vergleichbar mit jenen der Glucose waren.
Somit könnte es sich auch bei der Fructose um eine wichtige, natürliche
Kohlenstoff- und Energiequelle für heterotrophe Bakterien handeln. Für das
häufige Auftreten der Fructose konnte bisher noch keine befriedigende
Erklärung gefunden werden.
Natürliche Gewässer stellen sehr komplexe Medien dar, welche eine grosse
Vielfalt organischer Substrate enthalten. Neben den Zuckern spielen die
Aminosäuren wohl die wichtigste Rolle als Kohlenstoff- und Energiequelle
für heterotrophe Bakterien. Diese entstehen vor allem durch Hydrolyse von
Proteinen oder durch Ausscheidungen des Planktons. Bei den Aminosäuren
ist die Situation vom analytischen Standpunkt aus besser bestellt, sodass
wesentlich mehr Daten vorhanden sind als bei den Zuckern. Neuere Daten
aus der Literatur lassen den Schluss zu, dass die totale Konzentration der
freien Aminosäuren in der Grössenordnung der Zucker liegen (Dawson und
Pritchard 1978).
Die Kornpetition um die limitierende Kohlenstoff- und Energiequelle führt zu
einer Selektion, wobei diejenigen Bakterienarten dominieren, welche bei
einer gegebenen Substratkonzentration schneller wachsen und sich
vermehren können als andere. So konnte Jannasch (1968) in
Anreicherungsversuchen zeigen, dass, ausgehend von einer natürlichen
Population, bei hohen Substratkonzentrationen Enterobakterien dominierten,
während bei niedrigen Substratkonzentrationen andere Bakterienarten, z. B.
Pseudomonaden, selektive Vorteile besassen und überhand nahmen. Die
Abhängigkeit der spezifischen Wachstumsrate von der limitierenden
Substratkonzentration ist deshalb eine der fundamentalsten Beziehung in der
ökologischen Mikrobiologie.
Monod (1942) war der erste, der aufgrund experimenteller Daten eine
Beziehung zwischen der limitierender Substratkonzentration und der
spezifischen Wachstumsrate fand. Dieses sogenannte Monod-Modell (s. Kap.
3.2, Gl. 3.7) ist heute das am weitesten verbreitete Modell zur Beschreibung
der mikrobiellen Wachstumskinetik im Fliessgleichgewicht (steady state). In
diesem Modell ist die Beziehung der Wachstumsrate zum limitierenden
Substrat durch die beiden Parameter ~nax (spezifische maximale
Wachstumsrate der Bakterien unter den gegebenen Bedingungen) und K8
(Substratkonzentration bei µmax/2) bestimmt. K8 wird als apparente
Affinitätskonstante bezeichnet und gibt Hinweise auf die Affinität der Zelle
5
für ein bestimmtes Substrat. Das Monod-Modell ist formal gleich der
Michaelis-Menten Gleichung für die Enzymkinetik und beschreibt eine
rechtwinklige Hyperbel.
Obwohl das Monod-Modell für Kulturen im Fliessgleichgewicht (steady
state) angewandt wird, wurde die Beziehung der Wachstumsrate zur
limitierenden Substratkonzentration in den meisten Fällen in statischen
(Batch-) Kulturen ermittelt. Die Übertragung der Wachstumskinetik aus
Batchkulturen auf Kulturen im steady state scheint jedoch fraglich zu sein, da
sich in wachsenden Batchkulturen in keiner Phase ein echter steady state
ausbilden kann. Es ist deshalb in Batchkulturen nicht möglich, Substratlimitiertes Wachstum unter kontrollierten Bedingungen zu studieren.
Mit der Entwicklung der Chemostatzüchtungstechnik anfangs der 50-er Jahre
(Monod 1950, Novick und Szilard 1950) wurde es möglich, bakterielle
Kulturen für längere Zeit unter Substratlimitation in einem Fliessgleichgewicht wachsen zu lassen. Dabei muss das Medium so konzipiert sein,
dass alle essentiellen Nährstoffe mit Ausnahme des limitierenden Substrats
im Überfluss vorhanden sind. Durch die kontinuierliche Zugabe sterilen
Mediums werden die für das bakterielle Wachstum notwendigen Nährstoffe
dem Bioreaktor zugeführt. hn pH- und Temperatur-statisierten Reaktor findet
der Wachstumsprozess, d.h. die Umwandlung von Nährstoffen in Biomasse
und andere Endprodukte, statt. Da mit der gleichen Rate, wie frisches
Medium dem Reaktor zugeführt wird, Zellsuspension durch einen Überlauf
entfernt wird, bleibt das Volumen der Bakterienkultur konstant. Durch
Variation der Flussrate lässt sich jede beliebige spezifische Wachstumsrate
zwischen 0 < µ < µmax einstellen. Diese Eigenschaft macht den Chemostaten
zum geeigneten Instrument für die Eimittlung der Abhängigkeit der
Wachstumsrate von der Substratkonzentration. Trotz dieser Tatsache wurde
der Chemostat nur selten in diesen Zweig der mikrobiologischen Forschung
einbezogen, da diese Technik die Direktmessung des limitierenden Substrates
erfordert.
Die meisten bisherigen Versuche, die Restsubstratkonzentration unter
Kohlenstoff-Limitation zu bestimmen, scheiterten am Fehlen einer
geeigneten analytischen Methode. Bei den meisten bisherigen Methoden, die
für die Zuckerbestimmung angewandt wurden, war die Sensitivität
ungenügend; dies gilt insbesondere für die spektrophotometrischen und
refraktometrischen Detektionssysteme. Unter Anwendung solcher Systeme
6
men werden,
müsse n langwierige Konzentrationsschritte in Kauf genom
olumina
Probev
welche ihrerseits Fehlerquellen bergen und grosse
tivem Zucker
voraussetzen. Eine weitere Methode, die Zugabe von radioak
um tiefe
andt
angew
oft
sehr
en
ersuch
ins Medium, wurde in Batchv
Technik
diese
ist
n
imente
itexper
Konzentrationen zu bestimmen. In Langze
onsrate
Mutati
die
nzen
jedoch nicht zu empfehlen, da radioaktive Substa
Zelle
die
in
al
erheblich steigern können. Da ausserdem radioaktives Materi
in das Medium
eingebaut wird und durch Zellyse in irgendeiner Form wieder
eführt werden
gelangen kann, muss ein zusätzlicher Reinigungsschritt durchg
Bestimmung
die
wurde
selten
schend
(Robertson und Button 1977). Überra
6-Phosphat
lucoseinase/G
der Glucose im Chemostat durch die Hexok
enden
entsteh
Dehydrogenase Methode mit fluorimetrischer Detektion des
RestglucoseNADH angewandt. Rutgers et al. (1987), die damit die
hemostatkonzentrationen von Glucose-limitierten Klebsiella pneumoniae-C
dieser
mit
ungen
Erfahr
ihre
kulturen bestimmten, beschrieben jedoch
die
über
Urteil
kein
Stelle
Methode nur oberflächlich, sodass an dieser
Tauglichkeit dieser Methode abgegeben werden kann.
Bakterien gut
Die Anforderung an die Analytik eines für heterotrophe
len, besteht
verwertbaren Substrats, wie es Glucose und andere Zucker darstel
it 2.
dlichke
Empfin
grosse
end
Genüg
1.
n
im Wesentlichen aus drei Punkte
und
itung
aufbere
Proben
e
Selektive Detektion 3. Schnelle und einfach
Messung.
diese Kriterien
In der vorliegenden Arbeit wird eine Methode vorgestellt, die
reduzierender
in hohem Masse erfüllt. Die amperometrische Detektion
soweit
konnte
(1983)
Inoue
und
abe
Kohlehydrate mittels HPLC von Watan
und
ien
nsmed
achstur
W
ielle
angepasst werden, dass sie auch für mikrob
Umweltproben einsetzbar ist.
tnissen ist
Bakterielles Wachstum unter Kohlenstoff-limitierten Verhäl
Substrats.
renden
limitie
des
rtung
Verwe
verbunden mit der Aufnahme und
mehrere
durch
jedoch
wird
ere
Der Eintritt eines Nährstoffes in das Zellinn
die
durch
hnitt
Quersc
Barrieren erschwert. In Figur 1.1 ist schematisch ein
Zellhülle eines Gram-negativen Bakteriums dargestellt.
den LipoDie äussere Membran (ä. M.) wird gegen aussen von
(PL) und
n
olipide
Phosph
von
innen
polysacchariden (LPS) und gegen
Proteinen
von
Dicke
ganzen
Lipoproteinen (LP) gebildet. Diese wird in ihrer
handelt
Es
bilden.
(P) durchdrungen, welche die sogenannten Porine (PO)
7
innen
Fig. 1.1 Modell der Zellhülle von E. coli. Erklärungen siehe Text.
sich dabei um wassergefüllte Kanäle, welche den Durchtritt von hydrophilen,
niedermolekularen Substanzen ermöglichen. Die daran anliegende
Mureinschicht (M) behindert den Substratfluss nicht. Im periplasmatischen
Raum (p. R.), der zwischen der äusseren und der cytoplasmatischen
Membran (c. M) liegt, sind zahlreiche Proteine lokalisiert, z.B.
Depolymerasen, Phosphatasen sowie die peripheren Proteine der
Cytoplasmamembran. Auch die Substrat-bindenden Proteine (SBP), die eine
wichtige Rolle im Transportprozess gewisser Substrate innehaben, sind hier
zu finden. Die Cytoplasmamembran schliesslich entspricht dem FluidMosaik-Modell von Singer und Nicolson (1972), deren PhospholipidDoppelschicht die osmotische Barriere der Zelle darstellt. Die Transmembranproteine erfüllen dabei wichtige Funktionen als Carriers (CP) im
Transportprozess.
Die Aufnahme des Substrats vom Medium in die Zelle kann als erster Schri.tt
des Wachstumsprozesses betrachtet werden. Die Geschwindigkeit, mit der
Substrate unter Kohlenstoff-limitierten Bedingungen aufgenommen werden
können, ist deshalb eine entscheidende Grösse für die Konkurrenzfähigkeit
8
Bakterien spezielle
eines Mikroorganismus'. Es erstaunt deshalb nicht, dass
und selektive
rasche
eine
e
Aufnahmemechanismen entwickelt haben, welch
Aufnahme gewährleisten.
membran ist in der
Der Transport von Kohlehydraten durch die Cytoplasma
hme bildet der
Regel ein energieabhängiger Prozess; die einzige Ausna
ion in die Zelle
Transport von Glycerin, welches durch erleichterte Diffus
dargestellt. Alle
atisch
schem
gelangt (Lin 1976). Dies ist in Figur 1.2.a
entweder durch
n
Mono- und Disaccharide permeieren die Zellmembra
(Fig. 1.2.c). Diese
aktiven Transport (Fig. 1.2.b) oder Gruppentranslokation
atspezifität. Die
Transportsysteme sind charakterisiert durch ihre Substr
nreaktion durch
Enzyr
einer
analog
Kinetik der Substrataufnahme lässt sich
Permeasen
auch
b
deshal
n
eine Sättigungskurve beschreiben; sie werde
genannt.
aussen
®
s
©
@
f
innen
S-P
®',- @ :
/---P EP
Pyruvat
. a)
Transportarten für Kohlehydrate bei E. coli (schematisch)
c)
b) Aktiver Transport (H+-Symport).
Erleichterte Diffusion.
Text.
Gruppentranslokation. Nähere Erklärungen siehe
Fig. 1.2
9
Der aktive Transport (Fig. 1.2.b) ist die allgemeinste Transportart im
Bakterienreich. Die meisten Mono- und Disaccharide sowie organische und
anorganische Ionen gelangen auf diese Weise in die Zelle. Das
hervorstechendste Merkmal des aktiven Transports ist seine Fähigkeit,
Substrate gegen einen Konzentrationsgradienten in der Zelle zu
akkumulieren. Dieser Prozess ist energieabhängig, weshalb der aktive
Transport stets an eine Energiequelle gekoppelt ist. In erster Linie kommt als
Energiequelle ATP oder das Protonenpotential in Frage, in einigen Fällen
auch energiereiche Intermediate wie Acetylphosphat. In den meisten Fällen
ist die mittels des Protonenpotentials energetisierte Aufnahme von
Kohlehydraten mit einem gleichzeitigen Protonentransport in die Zelle
gekoppelt (H+-Symport); eine Ausnahme bildet der Melibiose-Transport
(Na+-Symport). Beispiele ffü Substrate, die durch das Protonenpotential
transportiert werden, sind Lactose (TMG-Pe1mease 1), Arabinose (araEPermease) und Galactose (Gal-Permease).
Die Transportsysteme, welche durch ATP oder eine andere energiereiche
Verbindung energetisiert werden, zeichnen sich durch grosse Affinität zu
ihrem Substrat aus. Sie werden als Schock-sensitive Transportsysteme
bezeichnet, da die Transportleistung durch die kalt-osmotische
Schockprozedur nach Neu und Heppel (1965) beeinträchtigt werden; dabei
werden Substrat-bindende Proteine aus dem periplasmatischen Raum
entfernt. Die genaue Funktion dieser Proteine im Transportprozess ist jedoch
noch nicht geklärt. Bei E. coli existieren mehrere solche Systeme, darunter
auch die hochaffinen Transportsysteme für Galactose (Mgl-Permease) und
Arabinose (araF-Permease).
Für eine weitergehende Literatur über den aktiven Transport bei E. coli sei
auf die Reviewartikel von Silhavy et al. (1978) und Henderson (1986)
verwiesen.
hn Gegensatz zum aktiven Transport wird bei der Gruppentranslokation das
transportierte Substratmolekül in chemisch modifizierter Form in das
Zellinnere gebracht (Fig. 1.2.c). Beim Phosphoenolpyruvat-abhängigen
Transportsystem (PTS) werden Zucker und Zuckeralkohole als deren
Phosphatester in die Zelle entlassen, wobei Phosphoenolpyruvat, ein
Metabolit der Glykolyse, als primärer Phosphoryldonor fungiert. Die
energiereiche Phosphatgruppe wird über das Enzym I (EI) auf ein Histidinhaltiges Protein (HPr) übertragen. EI und HPr sind lösliche Proteine und
katalysieren den Phosphoryltransfer aller durch das PTS transportierter
10
PTS.
Zucker (PTS-Zucker) und bilden die unspezifische Komponente des
III
Vom phosphorylierten HPr gelangt die Phosphatgruppe auf das Enzym
(EllI). Das Bill ist ein peripheres Membranprotein und in der Regel löslich.
ist die
Das Eill überträgt die Phosphatgruppe auf das Enzym II (Eil). Das Eil
Eli
Das
PTS.
des
onente
eigentliche Permease und Zuckererkennungskomp
die
lich
als integrale Komponente der Zellmembran katalysiert schliess
Bill
Phosphorylierung des permeierenden Substrats. Die Enzyme Eil und
PTS.
des
nente
bilden die zuckerspezifische Kompo
oft
Die verschiedenen Phosphotransferase-Systeme waren in jüngster Zeit
und
Postrna
von
Gegenstand intensiver Forschung. Der Reviewartikel
n
Lengeler (1985) vermittelt einen umfassenden Überblick über den aktuelle
Wissensstand.
-PTS
Glucose wird während des Transports durch das Glucose
der
ist
G6P
ryliert.
phospho
(ElIIGlcfEUGlc) zu Glucose-6-Phosphat (G6P)
und
se
Glykoly
ge,
Ausgangspunkt der für E. coli wichtigsten Zuckerabbauwe
ihren
Pentose-Phosphat-Weg (PP-Weg). Auch die Glykogensynthese hat
yAusgangspunkt in G6P. Der dritte wichtige Abbauweg, der 2-Keto-3-Deox
t.
beteilig
nicht
coli
E.
bei
bbau
6-Phosphogluconat-Weg, ist am Zuckera
erase in
hn glykolytischen Abbau wird G6P durch die Glucosephosphat-Isom
die
Fructose-6-Phosphat überführt, welches dann unter ATP-Verbrauch durch
wird.
oryliert
phosph
(FDP)
at
iphosph
e-1,6-D
Phosphofructokinase zu Fructos
FDP wird dann in der Folge durch die FDP-Aldolase in zwei Triosesphat
phosphate, Dihydroxyacetonphosphat und Glycerinaldehyd-3-Pho
Enzyme
gespalten. Letzteres wird durch die Aktion verschiedener
Die
schliesslich zu Pyruvat, dem Endprodukt der Glykolyse, überführt.
diaten,
Funktion der Glykolyse besteht in der Bereitstellung von Interme
für
seits
anderer
ums,
Wachst
des
e
einerseits für biosynthetische Prozess
die
Für
dienen.
Zelle
der
katabolische Prozesse, die dem Energiehaushalt
ig.
Energiegewinnung ist vor allem der Tricarbonsäure-Zyklus zuständ
e-5Synchron zur Glykolyse wird ein kleinerer Teil des G6P zu Ribulos
mit
ewicht
Gleichg
im
steht
Phosphat oxidiert. Ribulose-5-Phosphat
er
wichtig
ein
ist
s
Letztere
Xylulose-5-Phosphat und Ribose-5-Phosphat.
die
Durch
Baustein für die Nucleotid- und Nucleinsäuresynthese.
zu
Involvierung des PP-Wegs im Hexoseabbau gelangt die Zelle also leicht
C5-Zuckern.
11
tausenden von
Das Zellwachstum ist ein Prozess, der von hunderten, ja sogar
nte Anzahl
bekan
bisher
die
wird
biochemischen Reaktionen abhängig ist; so
angegeben
1000
über
verschiedener Proteine für eine E. coli-Zelle auf
komplex
sehr
Teil
(Ingraham et al. 1983). Alle Zellkomponenten, die zum
dungen.
sein können, entstehen dabei aus einfachen chemischen Verbin
tätigkeit der
ations
Regul
die
darin,
d
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestan
Abbau verder
indem
den,
wachsenden Zelle auf kinetischem Weg zu ergrün
. Vor
wurde
gt
verfol
schiedener Zucker unter unterschiedlichen Bedingungen
te
tumsra
Wachs
allem bei kleinen Substratkonzentrationen, wo die spezifische
die
kann statt deren
aus methodischen Gründen nur schwer zu bestimmen ist,
Aktivität und als
bielle
mikro
für
Mass
es
Substratverwertungsrate als genau
Wachstumsparameter gute Dienste leisten.
ob ein stabiler steady
- In Kapitel 3.1 sollte die Frage beantwortet werden,
Störung wieder
state erreicht wird und wenn ja, wie schnell er sich nach einer
ucosekonzentraeinstellt. Aus diesem Grunde wurde der Verlauf der Restgl
konstanten
unter
ultur
ostatk
tion einer Glucose-limitierten E.co/i-Chem
äusseren Bedingungen verfolgt.
tumsrate zur steady
- Ziel des Kapitels 3.2 war es, die Beziehung der Wachs
schon bestehenden
state Glucosekonzentration zu ermitteln und diese mit
onzentration einer
ucosek
Restgl
die
Modellen zu vergleichen. Deshalb wurde
nnungsraten
Verdü
n
iedene
Glucose-limitierten Chemostatkultur bei versch
ob sich
gen,
aufzei
gemessen. Zusätzliche Versuche mit Batchkulturen sollten
her Verfahrensdie so erhaltene Wachstumskinetik mit einer in kontinuierlic
diesbezüglich kein
weise erzielten vergleichen lässt. Da in der Literatur
Kapitels.
dieses
Punkt
ler
Unterschied gemacht wird, ist dies ein zentra
ation des Zuckerab- Die Kapitel 3.3 und 3.4 beschäftigen sich mit der Regul
gungen.
baus unter Kohlenstoff-limitierten resp. -gesättigten Bedin
Glucose-limitierten
einer
von
end
ausgeh
In Kapitel 3.3 wurde,
Versuche sollten
Chemostatkultur, auf ein anderes Substrat gewechselt. Diese
e geben. Die
System
r
lische
Auskunft über den Induktionsstand anderer katabo
an Glucose
eine
zentrale Frage dieses Kapitels war, wie schnell sich
eren kann. Die Veradaptierte Chemostatkultur an ein anderes Substrat adapti
und zeigt den
suche des Kapitels 3.4 wurden in Batchkulturen durchgeführt
andern im
eines
Abbau
den
auf
tionen
Einfluss von hohen Glucosekonzentra
Medium anwesenden Zuckers (Glucose-Effekt).
12
2. MATERIAL UND METHODEN
2.1 Organismen
Für alle Experimente wurde E. coli ML 30 (DSM 1329) verwendet. Die
Zellen wurden ca. 3 Monate in einem Glucose-limitierten Chemostat gehalten
und anschliessend auf Komplexmedium im Erlenmeyer weitergezüchtet.
Diese wurden dann in eine 10% DMSO-Lösung in sterile Ampullen gegeben
und in flüssigem Stickstoff als Stammkultur aufbewahrt. Aufgrund der
Züchtungsbedingungen mit verlängertem Wachstum auf Glucose bezeichneten Shehata und MruT (1971) den E. coli Stamm mit einem "G" (E. coli ML
30 G). Zur Kontrolle wurden die Bakterien regelmässig mit dem API 20 E
System kontrolliert.
2.2 Wachstumsbedingungen
Alle Experimente in kontinuierlicher Verfahrensweise wurden in einem Bioengeneering Bioreaktor (2000 KLF) mit einem Arbeitsvolumen von 1.05 l
durchgeführt. Die Bakterien wurden bei einer Temperatur von 37°C und bei
einem pH von 7.0 ± 0.02 gehalten, wobei der pH-Wert durch die automatische Zugabe einer je 1 M KOH/NaOH-Lösung reguliert wurde. Die Kultur
wurde mit 0.26 l/min Luft versehen und mit 1000 rpm gerührt. Auf diese
Weise fiel der 02-Gehalt nie unter 80% der Sättigung. Im Bioreaktor
herrschte ein kleiner Überdruck, der für die Siphonierung der überschüssigen
Kulturflüssigkeit verantwortlich war.
Für die Chemostatkultur wurde folgendes Mineralmedium verwendet (pro l
deionisiertes Wasser*):
* Das Wasser wurde mittels Ionentauschem deionisiert und anschliessend filtriert
(Porendurchmesser 0.2 µm)
13
NH4Cl
KH2P04
MgS04·7H20
EDTA
Na2Mo04-2H20
CaC0 3
FeCl3·H20
MnCl2-4H20
CuCl2·H20
C0Cl2·6H20
H3B03
0.763 g
2.72 g
59 mg
81.8 mg
2.6 mg
10 mg
2.03 mg
4.95 mg
0.85 mg
1.2 mg
0.31 mg
Das Mineralmedium wurde in 20 1- oder 50 1-Vorratsgefässen gemischt, mit
konzentrierter Schwefelsäure auf pH 3 gestellt und anschliessend
autoklaviert. Nach dem Abkühlen wurde die sterile Zuckerlösung in einer
Endkonzentration von 100 mg/l beigegeben. Die verwendeten Zucker (DGlucose, D-Galactose, D-Frnctose, D-Mannose, L-Arabinose) waren von
kommerziell erhältlichem höchsten Reinheitsgrad (puriss. grade, Gehalt >
99%, Fluka). Sie wurden in Erlenmeyerkolben in 200 ml destiliertem Wasser
gelöst, mit verdünnter Salzsäure auf pH 3 gestellt und anschliessend für 20
bis 30 Minuten autok:laviert.
Die Salzzusammensetzung des Mediums für die Batchversuche war hier
identisch mit der von Chemostatkulturen. Das Medium für die Batchversuche
wurde in 3 Fraktionen autok:laviert. Die Phosphatsalzlösung (Lösung 1)
wurde mit 5n NaOH auf pH 7,0 gestellt. Die übrigen Salze wurden in Lösung
2 vereint. Die Zuckerlösung (Lösung 3) wurde vor dem Autoklavieren auf pH
3 gestellt. Nach dem Abkühlen wurden die Lösungen im Volumenverhältnis
1:2:1 gemischt. Die Batchversuche wurden in 1 1 Erlenmeyerkolben bei
einem initialen Arbeitsvolumen von 400 ml durchgeführt und mit 1 ml einer
oben beschriebenen Chemostatkultur inokuliert; dies entspricht einer initialen
Bakterienkonzentration von ca. 0.12 mg TG/l. Die Batchkulturen wuchsen
bei 37°C und wurden mit einem magnetischen Rührer durchmischt. Der
Anfangs-pH von ca. 7.03 konnte sich während des Wachstums um ± 0.1
Einheiten verändern.
14
2.3 Bestimmung der Bakteriendichte
Die Bakteriendichte im Chemostat wurde sowohl turbidometrisch (lcmKüvette bei 546 nm) als auch nach Trockengewicht kontrolliert. Bei den
Batchversuchen, die mit kleinen Bakteriendichten durchgeführt wurden,
wurde die Bakteriendichte turbidometrisch mittels einer 5 cm-Küvette
bestimmt.
2.4 Methode der Spurenanalyse von Zockern in komplexen Medien
Im folgenden Teil wird eine Methode vorgestellt, die es erlaubt, eine Reihe
von Zuckern in biologischen Medien ohne vorherige Aufk:onzentration bis in
den µg/l-Bereich zu bestimmen. Die Analytik basiert auf der von Watanabe
und Inoue (1983) beschriebenen Methode, bei der reduzierende Kohlehydrate
mittels HPLC-Technik getrennt und anschliessend amperometrisch detektiert
werden. Im Verlauf der Experimente stellte sich jedoch heraus, dass die
Selektivität dieser Methode für die Fragestellung, Zucker in biologischen
Medien zu bestimmen, nicht ausreichend war, sodass die Proben vorher
aufbereitet werden mussten. Durch die Entsalzung der Proben mittels der
Elektrodialysetechnik (Josefsson 1971) konnten kleinere Ionen und mit ihnen
auch die interferierenden Stoffe aus den Proben entfernt werden. Die
Methode ist auch für natürliche Gewässerproben geeignet.
2.4.1 Bestimmung reduzierender Kohlehydrate nach Watanabe und Inoue
(1983)
In Figur 2.1 ist der Aufbau der HPLC-Anlage abgebildet. Die Trennung der
Zucker erfolgte durch Kationentauschersäulen (KS) in Ca- oder Pb-Form
(HPX-87C resp. HPX-87P, BioRad Lab.) mittels HPLC-Technik. Eine
optimale Trennung wurde bei einer Säulentemperatur von 85°C erreicht. Die
beiden Säulen unterschieden sich im Trennverhalten. Während sich mit der
Säule in Ca-Form schnellere Trennungen realisieren Hessen (ca. 30-40
Minuten für eine Probe aus dem Chemostat), war die Trennleistung der Säule
in Pb-Form besser. Durch letztere Hessen sich z.B. Fructose und Arabinose
15
Vergleich
mühelos trennen. Die Identifizierung der Peaks erlolgte durch den
Eluent
Als
.
Zucker
der Retentionszeiten rnit den Retentionszeiten bekannter
reduziertem
(E) wurde filtriertes destilliertes Wasser verwendet, das unter
AG) war
Druck entgast wurde. Eine pulslose Pumpe (P) (Model 8500,Varian
Um die
.
o1tlich
verantw
ml/h
für den konstanten Eluentenfluss von 30
die
wurde
ren,
bewah
analytische Säule vor Verunreinigungen zu
Lab.)
d
BioRa
P,
entsprechende Vorsäule (VS) (Carbo-C resp. Carboert. Das
zusammen rnit einer Fritte von 2 µm Porendurchmesser installi
je nach
Probevolumen des Injektors (Model 70-10, Rheodyne) betrug,
µl.
Problemstellung, zwischen 20 und 200
E
p
KS
R
p
WB
ECD
Figur 2.1 Aufbau der HPLC-Anlage. Erklärungen siehe Text.
16
Die Reagenslösung (R) setzte sich aus lg Cu II bis (Phenanthrolin) (CBP) in
1 l 0.05m Na2HP04 zusammen und wurde mit 5M NaOH auf pH 11.2
gestellt. Die Flussrate der Reagenslösung betrug 30 ml/h. Die Reagenslösung
wurde nach gleichem Verfahren entgast wie der Eluent. Die Eluens- und die
Reagenslösung vereinigten sich in einem T-Stück (T) und durchflossen in
einer 5 m langen Teflonkapillare (ID 0.5mm) ein 97°C heisses Wasserbad
(WB), wo die Nachsäulenreaktion stattfand.
Das Detektionsprinzip beruht auf der Reduktionskraft der Zucker in
alkalischer Lösung bei hohen Temperaturen. Es wird vermutet, dass bei der
Nachsäulenreaktion im CBP-Komplex Cu2+ zu Cu+ reduziert wird. In der
Zelle des elektrochemischen Detektors (ECD) (641-VA und 661-V A,
Metrohm) werden die Cu+-Ionen bei einem Potential von 80 mV, welches
durch eine Glassy Carbon Arbeitselektrode aufrechterhalten wurde, zu Cu2+
reoxidiert. Dieses kleine Potential ist ein Grund für die hohe Selektivität der
analytischen Methode, da die meisten organischen Stoffe bei wesentlich
höheren Potentialen oxidiert werden. Der durch die Oxidation von Cu+ zu
Cu2+ erzeugte Elektronenstrom wurde gleichzeitig von einem Schreiber
(W+W 600) und einem Integrator (hp 3390 A) aufgezeichnet. Die
Quantisierung der Peaks erfolgte in der Regel aufgrund der Peakhöhe.
2.4.2 Eichkurve und linearer Bereich
Das Ausmass des linearen Bereichs der Eichkurve war stark abhängig von
der CBP-Konzentration der Reagenslösung und der Grösse des
Probevolumens. Watanabe und Inoue (1983) berichten von einem linearen
Bereich von 0.02 bis 10 ppm Glucose bei einer CBP-Konzentration von 5
mM und einem Probevolumen von 20 µl. Wurde eine ca. 1.6 mM (1 g/l) CBP
Reagenslösung zusammen mit einem Probevolumen von 100 µl benutzt, so
reduzierte sich der lineare Bereich für Glucose von 20 µg/l bis ca. 0.5 mg/l
(Fig. 2.2). Die Form der Eichkurve hatte innerhalb eines gewissen Bereiches
starke Ähnlichkeit mit einer Sättigungskurve und liess sich durch eine
doppelt reziproke Aufzeichnung linearisieren (Fig. 2. 3). Diese
Linearisierungsmethode hatte für alle getesteten Zucker Gültigkeit. Dies war
in der Praxis von grosser Bedeutung, denn dadurch konnte auch im nichtlinearen Bereich der Eichkurve genaue Messungen durchgeführt werden.
17
100
80
,..--.,
<(
c
1--J
60
30
40
+
10
20
0
+
20
0
0
2
4
0
.5
6
8
1. 5
10
12
Glucose [mg/1]
lumen
Figur 2.2 Eichkurve für Glucose. CBP-Konzentration 1.6 mM, Probevo
llt.
dargeste
ereich
trationsb
Konzen
tiefe
100 µl. Im kleinen Quadranten ist der
500
400
300
...........
..- 200
100
0
0
2
4
6
8
10
12
1/Glucose
Figur 2.2.
Figur 2.3 Doppelt-reziproke Auftragung der Glucose-Eichkurve aus
0.99995.
=
(r2)
ffizient
ionskoe
Korrelat
µA-1.
X-Achse: (mg/l)-1, Y-Achse:
18
Der Vorteil lag darin, dass dadurch mit kleineren CBP-Konzentrationen
gearbeitet werden konnte. CBP-Konzentrationen von 1 g/l waren bei
Zimmertemperatur über Wochen stabil, während höhere Konzentrationen zu
Ausfällungen neigten. Der durch die Senkung der CBP-Konzentration
erlittene Sensitivitätsverlust konnte leicht durch ein grösseres Probevolumen
kompensiert werden. In Figur 2.4 wird der Einfluss des Probevolumens auf
den linearen Bereich gezeigt. Es ist ersichtlich, dass der lineare Bereich bei
der kleinen Probenmenge (20 µl) bedeutend grösser ist als bei der grossen
(200 µl). Auch das Flussratenverhältnis Reagens/Eluent (R/E) beeinflusste
den linearen Bereich. Mit zunehmendem R/E-Verhältnis vergrösserte sich der
quasilineare Bereich (Fig. 2.5. ). Ist man jedoch an kleineren Konzentrationen
interessiert (in Fig. 2.5 < 1 mg/1), so ist ein kleineres R/E-Verhältnis oft
günstiger.
100
80
,........,
<(
c:
..........
60
40
20
0
0
1
4
5
Glucose [mg/I]
2
3
6
Figur 2.4 Einfluss des Probevolumens auf den linearen Bereich der GlucoseEichkurve. [!] 20 µl; 6 100 µl.
19
140
120
,.......,
<(
c:
........
100
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8
Glu cos e [mg/I]
10
12
uenslösung (R!E)
Figur 2.5 Einfluss des Flussratenverhältnisses Reagens-/El
auf die Glucose-Eichkurve. 6. R/E = 1; C!l R/E = 2.
2.4.3 Probenahme und Filtration
Probenahmeöffnung
Die Proben aus dem Chemostaten wurden aus einer
Durchmesser) direkt
durch ein kurzes Schlauchstück (ca. 20 cm lang, 2 mm
welches an eine
et,
in ein Filtrationsgerät (sterifil, Millipore) geleit
nahme wurden dem
Wasserstrahlpumpe angeschlossen war. Pro Probe
gut die Hälfte auf den
Chemostat ca. 10 ml Flüssigkeit entzogen, wobei
dass während des
Vorlauf entfiel. Da man annehmen musste,
war eine schnelle
Filtrationsvorgangs weiter Substrat abgebaut wird,
eine repräsentative
um
Trennung der Zellen vom Kulturmedium nötig,
ein relativ grosser
Chemostatprobe zu erhalten. Aus diesem Grund wurde
rienkultur (ca. 45 mg/l)
Filterdurchmesser (47 mm) sowie eine dünne Bakte
en betrug deshalb
gewählt. Die Filtrationszeit für ca. 3-5 ml Probevolum
während der Filtration
weniger als 3 sec. Die allfällige, von den Zellen
3.2) abschätzen. Bei
(Kap.
abgebaute Zucker lässt sich nach Gleichung 3.14
20
einer Wachstumsrate von 0.88 h-1 beträgt die Abbaurate ca. 24 µg/l (s. Fig.
3.7), bei einer von 0.2 h-1 ca. 5.5 µg/l pro Sekunde. Für Proben, die in
schneller Folge entnommen werden mussten; wurde ein Mehrfachfiltrationsgerät (Millipore) verwendet, das an eine Vakuumpumpe angeschlossen war.
Bedingt durch einen kleineren Filterdurchmesser (25 mm) betrug hier die
Filtrationszeit für das gleiche Probevolumen 8-10 Sekunden.
Es wurde eine Reihe kommerziell erhältlicher Filtertypen geprüft. Es zeigte
sich, dass verschiedene Filtertypen kleine Mengen von Glucose und Fructose
abgeben können. Dies ist in Figur 2.6 dokumentiert, wo 5 ml destilliertes
Wasser durch einen ungespülten Filter gelassen wurde. Deshalb wurden alle
Filtrationen mit dem Filtertyp Durapore hydrophil (Millipore) durchgeführt,
welcher keine interferierende Stoffe abgab und durch seine Hydrophilie eine
schnelle Filtration gewährleistete.
a
5
10
G
5
10
20 min
15
15.
F
b
20 min
Figur 2.6 Chromatogramm der eluierten Zucker aus Filtern, nachdem ca. 5 ml
destilliertes Wasser durch einen benetzten Filter gelassen wurde. a) Gemischter
Ester aus Celluloseacetat und Cellulosenitrat 0.2 µm (Millipore); Glucose (G) =
0.046 mg/l, Fructose (F) =ca. 0.02 mg/l. b) Polycarbonat 0.4 µm (Nuclepore);
Glucose (G) =0.08 mg/l, Fructose (F) = 0.075 mg/l. Säule: HPX-C.
21
2.4.4 Entsalzung
zt. Die Entsalzung der
Nach der Filtration wurden die Proben sofort entsal
sson 1971) realisiert.
Proben wurde durch die Elektrodialysetechnik (Josef
der Entsalzung mittels
Diese Technik ist der konventionelleren Art
tauscherharze trotz
Ionentauschern vorzuziehen, da alle getesteten Ionen
Entsalzung war aus
Die
en.
vorheriger Reinigung interferierende Stoffe abgab
ile mit sich:
mehreren Gründen notwendig und brachte viele Vorte
Salzkonzentrationen und
l. Entfernung interferierender Stoffe. Die hohen
ieren mit einer ganzen
vermutlich auch geladene organische Stoffe coelu
auch Glucose) und
Reihe von Mono- und Disacchariden (u.a.
verunmöglichen deren Analyse (s. Fig. 2.7).
nur schlecht löslich in
2. Kationen wie Fe2+, Mg2+, oder Ca2+ sind
nslösung fallen sie
alkalischer Lösung. In Kontakt mit der alkalischen Reage
uf der Grundlinie oder
als Hydroxide aus und stören den ruhigen Verla
verstopfen die Kapillaren.
wesentlich erhöht.
3. Die Lebensdauer der analytischen Säule wird
n Kationen des
Organische Säuren können die amino-gebundene
eriert werden muss.
Ionentauscherharzes lösen, sodass die Säule häufig regen
stabil und lassen sich
4. Entsalzte Proben sind bezüglich des Zuckergehaltes
n.
gefroren über Wochen ohne Zuckerverluste aufbewahre
Niederschlag, wenn
kein
sich
5. Problemloses Aufkonzentrieren. Es bildet
n.
werde
Proben mittels Rotationsverdampfer aufkonzentriert
von Josefsson (1971) in
Die Elektrodialysegeräte wurden nach der Anleitung
men von 2.5 ml. Als
unserem Labor gebaut und hatten ein Probekammervolu
in den beiden
wurde
Elektroden diente Platindraht. Als Elektrolyt
Die Ioneng/l).
0.5
Aussenkammern eine NaCl-Lösung verwendet (ca.
of, Westdeutschland,
selektiven Membranen (AMV, CMV) sind bei Bergh
ranen verwendet. Ein
erhältlich. Für jede Probe wurden neue Memb
acia) wurde benutzt um
Speisegerät für Elektrophoresen (ECPS/150, Pharm
Stromstärke von 30
aler
ein Potential von maximal 500 V DC bei maxim
ostatprobe dauerte in der
mA aufrecht zu halten. Die Entsalzung einer Chem
der Strom auf weniger
Regel 20 bis 30 Minuten; nach dieser Zeitspanne fiel
Proben deutet.
als 1 mA, was auf eine fast vollständige Entsalzung der
22
2.4.5 Chromatogramme
Nach der Entsalzung wurden die Proben entweder sofort analysiert oder bei
-15°C aufbewahrt. Vor dem Injizieren wurden die Proben kurz mit Helium
begast um den Sauerstoff zu entfernen.
In Figur 2.7 sind zwei Chromatogramme derselben Probe einer Glucose
limitierten Chemostatkultur von E. coli abgebildet, in Figur 2.7.a in
entsalzter, in Figur 2.7.b in nicht entsalzter (d.h. nur filtrierter) Form. Man
sieht, dass in der salzhaltigen Probe die Bestimmung der Glucose (G) wegen
interferierenden Stoffen unmöglich war. Bei den anderen Peaks, die
identifiziert werden konnten, handelt es sich wahrscheinlich um lsomaltose
(F).
(1), eine Verunreinigung der Glucose-Chemikalie, sowie Fructose
G
a
b
0
10
20
30
min
Figur 2.7 Chromatograrnm einer Glucose-limitierten Chemostatkultur von
E. coli. a) Probe filtriert und entsalzt. b) Probe nur filtriert.
Glucose (G) = 80 µg/l, Fructose (F) 20 µg/l, 1 = Isomaltose. Säule: HPX-C;
Probevolumen 100 µl.
23
Fructose trat in fast allen Proben Glucose-limitierter E. coli Kulturen auf; auf
die möglichen Ursachen des Fructosevorkommens wird später eingegangen
(Kap. 2.4.6 und 3.1). Die Analysezeit für eine Chemostatprobe betrug etwa
30 Minuten.
Noch bessere Trennungen erlaubte die Installation einer zweiten analytischen
Säule. Figur 2.8 zeigt das Chromatogramm einer Glucose-limitierten
Chemostatkultur, Figur 2.9 das einer Galactose-limitierten Chemostatkultur.
Die Trennung erfolgte in beiden Fällen durch Serieschaltung der Säulen
HPX-87C und HPX-87P. Die Glucose- (G}, Galactose- (Ga) und Fructose(F) Peaks sind nun alle basisliniengetrennt, was vor allem für die
Bestimmung von kleinen Konzentrationen von Vorteil ist.
G
5nA
10
20
F
30
40 min
Figur 2.8 Typisches Chromatogramm einer Glucose-limitierten Chemoca. 20 µg/l,
statkultur von E. coli. Glucose (G) = 49 µg/l, Fructose (F)
Galactose.
um
eise
1 = Isomaltose. Beim Ga?-Peak handelt es sich möglicherw
Säulen: HPX-C und HPX-P in Serie. Probevolumen 200 µl.
=
24
Die Verunreinigungen der Zuckerchemikalien, <lie wahrscheinlich auf Kondensationsreationen zurückzuführen sind, wirkten sich oft störend aus. Sehr
viel Raum des Chromatogramms beanspruchte die Verunreinigung der Galactose (V); sie bestand aus mindestens drei Komponenten (Fig. 2.9). Diese
Ga
V
F
20
30
40 min
Chromatogramm einer Galactose-limitierten Chemostatkultur.
820 µg/l, Fructose (F) = 37 ~lg/l, V= Verunreinigungen der
(Ga)=
Galactose
Galactose. Säulen: HPX-C und HPX-P in Serie. Probevolumen 100 µl.
Figur 2.9
Produkte wurden von E. coli nicht oder nur wenig abgebaut; dies konnte
durch den Vergleich mit einer Standardlösung gleicher Konzentration (100
mg/l) ermittelt werden. Dasselbe galt auch für die Isomaltose bei Glucoselimitierten Kulturen. Es ist anzunehmen, <lass diese bei höheren Eingangssubstratkonzentrationen zunehmen, was zu Trennungsproblemen führen
köm1te.
Mit Ausnahme der Galactose Hessen sich alle verwendeten Zucker (Fructose,
Mannose, Arabinose) problemlos von der Glucose trennen. Eine saubere
Trennung der Galactose liess sich bei höheren Konzentrationen nur durch
drei Säulen in Se1ie realisieren, wobei meist zwei HPX-C- und eine HPX-P-
25
erbreiterung erwies
Säule verwendet wurde; die dadurch entstandene Peakv
sich nicht als Problem.
n sich nach derselben
Auch Zucker aus Proben natürlicher Gewässer Hesse
atogramm des Wassers
Methode bestiJ1111len. In Figur 2.10 ist das Chrom
Bachs abgebildet. Die
eines in der Nähe des Instituts gelegenen
sehr gering, sodass eine
Konzentrationen von Glucose und Fructose waren
aporation nötig war.
vorherige Aufkonzentration ( 3.6 mal) durch Rotationsev
2nA
10
tG
15
20
25 min
(Bach in der Nähe
Figur 2.10 Chromatogramm einer Probe aus dem Kriesbach
rdampfer 3.6 mal
des Instituts). Das entsalzte Wasser wurde mittels Rotationsve
Glucose (G)
für
betrug
n
aufkonzentriert. Die ursprüngliche Konzentratio
µl.
200
n
olume
18 µg/l und für Fructose (F) 5 µg/l. Säule: HPX-C. Probev
icher Gewässer stets
Obwohl die Zuckerkonzentrationen bei Proben natürl
atogramme deutlich von
sehr gering waren, unterschieden sich diese Chrom
n Wassers; letztere
jenen des Leitungswassers oder des deionisierte
ch identisch mit der
Chromatogramme waren über den ganzen Berei
Porenwassers einer
des
mm
Basislinie. In Figur 2.11 ist das Chromatogra
ildet. Man kann
abgeb
Sedimentprobe aus dem Zürichsee in ca. 140 m Tiefe
rähnlicher Substanzen
ein ganzes Spektrum verschiedener Zucker oder zucke
26
erkennen, von denen nur Glucose (G), Fructose (F) und Ribose(R)
identifiziert wurden.
G
F
R
10
20
30
40
50
60
70
min
Figur 2.11 Porenwasser aus dem Sediment des Zürichsee in 140 m Tiefe, ca.
10 cm unter der Sedimentoberfläche entnommen. Glucose (G) = 0.36 mg/l,
Fmctose (F) = 0.071 mg/l, Ribose (R) = 0.1 mg/l. Alle übrigen Peaks wurden
nicht identifiziert. Säulen: HPX-C und HPX-P in Serie. Probevolumen 100 µl.
2.4.6 Isomerisation
Zucker sind in alkalischer Lösung unstabil, weil Zucker durch
Isomerisationsreaktionen in andere Zucker übetführt werden. Glucose z.B.
kann leicht zu Fructose und zu einem kleineren Teil zu Mannose isomerieren.
Die Aldose-Ketose Isomerisation erfolgt über ein Endiol (Lobry de Bruynvan Eckenstein Transformation). Die Transformationsrate wird durch Wärme
gefördert. Mopper et al. (1980) konnten zeigen, dass ca. 30% der Glucose
27
halb 24 h bei 80°C zu Fructose
einer schwach basischen Glucoselösung inner
ksichtigt werden, wenn
transformiert wurden. Dies muss berüc
Autoklavieren einer wässrigen,
Zuckerlösungen autoklaviert werden. Beim
20 Minuten bildete sich eine
neutralen Glucoselösung (100 mg/l) während
end bei vorheriger Senkung
beträchtliche Menge Fructose (Fig. 2.12.a), währ
vernachlässigbar kleine
des pH mit verdünnter Säure höchstens
en konnten (Fig. 2.12.b). Ohno
Fructosekonzentrationen nachgewiesen werd
sauren Milieu lsomerisationen
und Ward (1960) konnte zeigen, dass auch im
uten, dass in saurer Lösung die
möglich sind. Harris und Feather (1975) verm
asserstoffttansfer erfolgt.
lsomerisation durch einen intramolekularen W
F
a
b
10
20
min
ldung nach 20-minütigem
Figur 2.12 Einfluss des pH auf die Fructosebi
Die Glucose wurde nach dem
Autoklavieren einer Glucoselösung (100 mg/I).
abgebaut. F = Fructose,
Abkühlen der Lösung durch Glucose-Oxidase
1 = Isomaltose.
a) neutraler pH. Fructosekonzentration =0.5 mg/l.
b) pH 3.8.
28
Das Autoklavieren von Zuckern zusammen mit der Minerallösung führte
selbst bei tiefem pH zu unspezifischen Reaktionen. Figur 2.13 zeigt das
Chromatogramm einer Glucose-limitierten Kultur von E. coli, wobei Glucose
zusammen mit der Minerallösung bei pH 3 autoklaviert wurde. Mit N sind
die dadurch entstandenen Nebenprodukte bezeichnet, welche von E. coli
nicht abgebaut wurden. Bei den Nebenprodukten könnte es sich um
derivatisierte Furane und Furaldehyde handeln (Harris und Feather 1972).
Aus diesem Grund wurde bei der Zubereitung des Mediums die Zucker stets
separat von der Salzlösung autoklaviert
N
G
F
i
10 15 20 25 30 min
Figur 2.13 Chromatogramm einer Glucose-limitierten Chemostatkultur von
E. coli. Für die Mediumzubereitung wurde die Glucoselösung zusammen mit
der Minerallösung bei pH 3 autoklaviert. N = Nebenprodukte, G = Glucose
(ca. 40 µg/l), F = Fructose, 1 = Isomaltose.
29
3. RESULTATE (EXPERIMENTE)
KAPI TEL3 .1
Verh alten des Restsubstrates einer Glucose-limitierten
Chem ostat kultu r von E. coli
a. Einleitung
t, über längere
Der Chemostat ist ein Instrument, welches den Zellen erlaub
~onstante Zugabe
Zeit unter konstanten Bedingungen zu wachsen. Durch die
gt, die sie für
versor
toffen
frischen Mediums werden die Bakterien mit Nährs
ostatkultur
Chem
das Wachstum gebrauchen. Da das Arbeitsvolumen der
Medium zugeführt
konstant bleibt, wird zu gleichen Teilen, wie frisches
wird, Zellsuspension aus dem Reaktor entfernt.
eine MassenDie Konzentration der Biomasse im Chemostat kann durch
bilanz beschrieben werden:
im Abfluss
Bakterienkonzentration = Bakterienwachstum - Bakterien
Für einen infinitesimal kleinen Zeitabschnitt dt gilt (Pirt 1975)
(3.1)
Vd.x =Vµ xdt-F xdt
µ die spezifische
wobei dx die Veränderung der Bakterienkonzentration,
iendichte, F die
Bakter
ntane
Wachstumsrate der Bakterien, x die mome
bezeichnet.
ostats
Chem
Mediumszuflussrate und V das Arbeitsvolumen des
Die Division der Gleichung 3.1 durch V.dt ergibt
dx/dt = µX - F XI V
(3.2)
pro Zeiteinheit
Der Ausdruck FN bezeichnet die Anzahl Voh~menwechsel
gewicht (steady
und wird als Verdünnungsrate (D) bezeichnet. Im Fliessgleich
30
state) bleibt die Bakteriendichte konstant, sodass der Term dx/dt null wird.
Daraus folgt
µ = D
(3.3)
Gleichung 3.3 könnte zu der Annahme verleiten, dass sich jede Einzelzelle
der Chemostatkultur mit einer spezifischen Wachstumsrate µ, deren Grösse
der Verdünnungsrate D entspricht, vermehrt. Es ist jedoch bekannt, dass sich
eine Chemostatkultur nicht aus physiologisch einheitlichen Einzelzellen
zusammensetzt. Ein Teil der Zellen sind metabolisch inaktiv und können
lysieren, während andere Substrat abbauen, jedoch nicht teilungsfähig sind.
Auch die spezifischen Wachstumsraten teilungsfähiger Zellen müssen nicht
unbedingt identisch sein. Genotypische Variationen, die z.B. durch spontane
Mutationen entstehen, können die spezifischen Wachstumsraten der
Einzelzellen beeinflussen. Gemäss diesem Konzept istµ in Gleichung 3.3 als
Durchschnittswert der spezifischen Wachstumsraten aller Einzelzellen zu
betrachten.
Im steady state sind alle messbaren Parameter der Kultur konstant; dies trifft
sowohl für die zellulären als auch für die extrazellulären Komponenten zu.
Deshalb wird unter konstanten äusseren Bedingungen eine konstante Restsubstratkonzentration erwartet.
Als Kriterium für den steady state wird in den meisten Fällen eine konstante
Populationsdichte gewählt, welche üblicherweise turbidometrisch oder
gravimetrisch bestimmt wird. Bei den Mikrobiologen gilt als Faustregel, dass
sich nach einer Störung innerhalb von 7 Volumenwechseln(= Generationen)
ein neues Gleichgewicht einstellt. Diese Definition berücksichtigt nach
Harrison und Topiwala (1974) jedoch nur die schnellsten Adaptionsprozesse.
So konnten Rutgers et al. (1987) bei einer Glucose-limitierten Chemostatkultur von Klebsiella pneumoniae zeigen, dass zusätzlich zum Kriterium der
konstanten Populationsdichte in der Regel 40-60 Volumenwechsel nötig
waren, ehe die Glucosekonzentration einen konstanten Wert annahm. Höfle
(1983) konnte selbst nach 200 Volumenwechseln noch eine signifikante
Abnahme der limitierenden Glucosekonzentration bei einer Cytophaga
johnsonae-Chemostatkultur beobachten.
Diese Resultate zeigen, dass es wichtig ist, die limitierende Substratkonzentration nach einer Störung zu verfolgen, um eine steady state
Konzentration definieren zu können.
31
In' diesem Kapitel wurde die Glucosekonzentration einer Glucose-limitierten
E. co/i-Chemostatkultur nach einer Störung, die durch das Heraufstellen der
Verdünnungsrate verursacht wurde, in kurzen Abständen bestimmt. Dabei
interessierten vor allem die Fragen, wie schnell sich die neue steady state
Glucosekonzentration einstellen wird und innerhalb welchem Bereich diese
schwanken wird. Nach dem Umstellen der Verdünnungsrate wurde die Kultur
für mindestens 100 Volumenwechsel unter konstanten Wachstumsbedingungen belassen; dadurch sollte die Frage abgeklärt werden, ob die
Restsubstratkonzentration auch über längere Zeitintervalle konstant bleibt.
b. Resultate
Die Restsubstratkonzentrationen Glucose-limitierter Chemostatkulturen von
E. co/i wurden nach Änderung der Verdünnungsrate verfolgt (Fig. 3.1.-3.3).
Die Kulturen wurden vorgängig über längere Zeit (ca. 50 Volumenwechsel)
bei der Verdünnungsrate Dl gehalten, sodass eine Adaption der Zellen an
diese Verhältnisse vor dem Umstellen auf die Verdünnungsrate Dz
gewährleistet war. Um den Einfluss der Probeentnahmen auf die Kultur
möglichst klein zu halten, wurde zwischen den einzelnen Probenahmen
mindestens zwei Volumenwechsel abgewartet. Der Inhalt des Reservoirgefässes umfasste 50 l; es war also nötig, das Reservoirgefäss von Zeit zu
Z_eit mit frischem Medium zu versehen. Der Zeitpunkt des Mediumwechsels
ist in den Figuren 3.1 bis 3.3 mit Pfeilen markiert.
Beim in Figur 3.1 dargestellten Experiment wurde die Verdünnungsrate von
D1:::; 0.4 h-1 auf Dz:::; 0.74 h-1 erhöht. Die steady state Glucosekonzentration
bei D:::; 0.4 h-1 betrug etwa 50 µg/l (s. auch Kap. 3.2) und ist in Figur 3.1 mit
einem Stern symbolisiert. Es zeigte sich, dass nach dem Umstellen die
Glucosekonzentration schon während den ersten 10 Volumenwechseln Werte
annahm, welche den steady state Wert bei dieser neuen Verdünnungsrate
repräsentieren. Der Mittelwert der Restglucosekonzentration während den
ersten 70 Volumenwechseln betrug 467 µg/l. Darauf folgte eine kleine
Störung, in deren Verlauf sich Fructose im Medium akkumulierte. Die
mittlere Glucosekonzentration in dieser Phase war im Vergleich zu den
übrigen Werten mit 553 µg/l leicht erhöht. Der Mittelwert der Proben, die
zwischen 130 und 140 Volumenwechseln entnommen wurden, betrug für
32
Glucose 498 µg/l und war damit nur unwesentlich höher als der während den
ersten 70 Volumenwechseln erhaltene Mittelwert.
Figur 3.2 zeigt ein weiteres Experiment, bei welchem die Verdünnungsrate
von D1 = 0.4 h-1 auf Dz = 0.69 h-1 erhöht wurde. Den Verlauf der Restglucosekonzentration kann man hier in zwei Bereiche einteilen. Der steady
state Wert bei dieser Verdünnungsrate (s. Kap. 3.2) wird durch die Proben,
die während der ersten 75 Volumenwechseln entnommen wurden, mit einem
Mittelwert von 470 µg/l gut repräsentiert. Danach nimmt die Glucosekonzentration kontinuierlich ab und nimmt nach ca. 125 Volumenwechseln
einen Wert von ca. 200 µg/l an.
In Figur 3.3 ist der Verlauf der limitierenden Glucosekonzentration während
120 Volumenwechseln eingezeichnet, nachdem die Verdünnungsrate von
D1 = 0.19 h-1 auf Dz = 0.4 h-1 erhöht wurde. Die Glucosekonzentration stieg
sehr schnell von ca. 15 µg/l (= steady state Konzentration bei D = 0.19 h-1)
auf ca. 50 µg/l und blieb über längere Zeit ziemlich konstant. Nach 70
Volumenwechseln nahm die Glucosekonzentration sprunghaft zu und
erreichte einen Wert von beinahe 400 µg/l; parallel dazu stieg auch die
Fructosekonzentration, die bis anhin in einer tiefen Konzentration zwischen
10 und 20 µg/l vorgelegen hatte. Solche "Störungen" traten relativ selten auf,
konnten aber während der über 2-jährigen Messperiode bei allen
Verdünnungsraten beobachtet werden (vgl. auch Fig. 3.1 zwischen 70 und 90
Volumenwechseln). In Figur 3.4 ist eine kleinere Störung aufgezeichnet, die
ca. 1 Stunde dauerte; die Glucose-limitierte Chemostatkultur wurde über
längere Zeit bei D = 0.4 h-1 gehalten. Zu Beginn der Messperiode betrug die
Glucosekonzentration ca. 15 µg/l und war damit deutlich unter dem steady
state Wert von ca. 50 µg/l; nach der Störung lagen die Messwerte zwischen
46 µg/l und 55 µg/l und damit im Bereich der steady state Konzentration.
Auffällig bei allen Störungen war das synchrone Auftreten der Fructose
zusammen mit erhöhten Glucosewerten.
,---,
800
............
01
:::i
L--1
600
.+-J
ro
lo-
.+-J
Cf)
400
~
Cf)
.+-J
Cf)
200
i
..0
(1)
cc
0
...,
~4
I
J
1
0
40
20
60
80
<,>
\
\
b.
100
120
Volumenwechsel (Generationen)
140
Figur 3.1 Verlauf der Glucose- (l!l) und Fructosekonzentration (6) einer Glucose-limitierten Chemostatkultur von E. coli
nach Umstellen der Verdünnungsrate (D) von D1 = 0.4 h-1 auf D2 = 0.74 h-1. Wo nicht angegeben lag die
bezeichnet die steady state Glucosekonzentration bei D 1. Der Zeitpunkt des
Fructosekonzentration meist um 10 µg/l.
Mediumswechsels ist mit einem Pfeil (i) markiert.
*
800
r--i
'-....
CJ')
:::1 600
.____.
-+--'
CU
~
-+--'
Cf)
400
...0
:::J
Cf)
-+--'
Cf)
(})
200
w
+>-
0:
0
20
40
60
80
100
120
140
Volumenwechsel (Generationen)
ten Chemostatkultur von E. coli nach Umstellen der
Figur 3.2 Verlauf der Glucosekonzentration ([!)) einer Glucose-limitier
konzentration lag meist um 10 µg/l. *bezeic hnet die
Verdünnungsrate (D) von D1 = 0.4 h-1 auf D:z = 0.69 h-1. Die Fructose
ls ist mit einem Pfeil (i) markiert.
steady state Glucosekonzentration bei D1. Der Zeitpunkt des Mediumswechse
500
r-i
.............
O')
:::l
400
L--l
-+-'
CU
~
300
-+-'
Cf)
..0
::::3
200
Cf)
-+-'
Cf)
Q)
a:::
100
0
0
20
40
60
80
100
120
Volumenwechsel (Generationen)
(6.) einer Glucose-limitierten Chemostatkultur von E. coli
Figur 3.3 Verlauf der Glucos e-([!]) und Fructosekonzentration
h-1 auf D2 = 0.4 h-1. Wo nicht angegeben, lag die
nach Umstellen der Verdünnungsrate (D) von D1 = 0.19
Zeitpunkt des
bezeichnet die steady state Glucosekonzentration bei D 1. Der
Fructosekonzentration meist um 10 µg/l.
Mediumswechsels ist mit einem Pfeil (i) bezeichnet.
*
36
120
,..--,
.............
Ol
:::i
L--J
-+-'
ro
~
-+-'
Cf)
...0
::J
Cf)
-+-'
Cf)
Q)
0:
100
80
60
40
20
0
0
60
120
180
240
300
360
Zeit rminl
sekonzentration ( 6. ) einer
Figur 3.4 Verlauf der Glucose- ( [!) ) und Fructo
D =0.4 h-1 während einer
Glucose-limitierten Chemostatkultur von E. coli bei
. Wo nicht angegeben,
Störung. t = 0 bezeichnet den Beginn der Messperiode
lag die Fructosekonzentration meist um 10 µg/l.
c. Diskussion
ONZE
1. DEFIN ITION DER STEADY STATE GLUCOSEK
NTRATION
einer Störung, die durch
Der Verlauf der Glucosekonzentration wurde nach
wurde, über längere Zeit
das Umstellen der Verdünnungsrate verursacht
die Zellen sehr schnell an
sich
verfolgt. Es konnte festgestellt werden, dass
schon innerhalb weniger
die neue Situation anpassen konnten, denn
Bereich der steady state
Generationen lag die Glucosekonzentration im
Konzentration.
einer konstanten RestsubEin idealer steady state würde sich in
n jedoch, dass kleinere
zeigte
stratkonzentration ausdrücken. Die Resultate
37
bekannt, ob diese
Konzentrationsschwankungen normal waren. Es ist nicht
kte, die von
Artefa
auf
Schwankungen auf die Mängel der Chemostattechnik,
it
tätigke der Zellen
der Methodik herrühren und/oder auf die Regulations
ch des Restsubstrats
zuruckzuführen sind. Der prozentuale Schwankungsberei
kleiner als bei den
war bei den höheren Verdünnungsraten in der Regel
dass sich bei den
sein,
det
begrün
tieferen (D < 0.3 h-1 ). Dies könnte darin
insbesondere
chnik,
kleinen Verdünnungsraten die Mängel der Chemostatte
kten als bei den
die tropfenweise Zugabe des Mediums, stärker auswir
sein. In den meisten
höheren. Ein Störfaktor scheint der Mediumswechsel zu
hafte Zu- oder AbFällen konnte nach Zugabe frischen Mediums eine sprung
Störungen wurden
Die
n.
werde
nahme der Glucosekonzentration beobachtet
ein in allen Komwar,
wahrscheinlich dadurch verursacht, dass es unmöglich
lfall legten sich
ponenten identisches neues Medium herzustellen. Im Norma
solche Störung nach maximal 5 bis 10 Volumenwechseln.
in welchen sich die
Figur 3.1 bis 3.3 zeigen, dass längere Phasen existierten,
tration nur geringonzen
aufeinanderfolgenden Messungen der Restglucosek
n die einzelnen
fügig unterschieden. In solchen Phasen wiche
te vom Mittelwert
Glucosekonzentrationen in der Regel nur wenige Prozen
n Einzelmessungen
der Einzelwerte ab. Der Mittelwert aus mehreren solche
hnet.
bezeic
tion
zentra
sekon
wird in der Folge als steady state Gluco
nd den ersten
währe
tionen
In Figur 3.2 repräsentieren die Glucosekonzentra
srate recht
nnung
60 Volumenwechseln den steady state Wert bei dieser Verdü
sekonzentrationen
gut (s. Kapitel 3.2). In der Folge sanken jedoch die Gluco
anzunehmen, der
kontinuierlich um bei ca. 120 Volumenwechseln einen Wert
In einem solchen
etwa der Hälfte der steady state Konzentration entspricht.
erschwert oder
n
ntratio
Fall wird die Festlegung einer steady state Konze
Kulturen, die
bei
sogar verunmöglicht. Dieses Verhalten konnte vor allem
n. Das in Figur
längere Zeit im Chemostat exponiert waren, beobachtet werde
ostatkultur durch3.2 dokumentierte Experiment wurde mit einer Chem
sraten gehalnnung
Verdü
n
iedene
versch
geführt, die über ein halbes Jahr bei
Werte nicht
ten
frühes
die
sich
n
ten wurde. In Figur 3.1 hingegen unterschiede
wurden. In
sen
gemes
wesentlich von denen, die nach 140 Volumenwechseln
zentration
sekon
solchen Fällen ist die Festlegung einer steady state Gluco
Monate bei verunproblematisch. Diese Chemostatkultur wurde ca 1.5
chiedlich lange
schiedenen Verdünnungsraten gehalten. Die unters
Verhalten der
iche
chiedl
unters
Expositionszeit könnte eine Erklärung für das
beiden Kulturen sein.
38
selektiven Druck auf die Zellen
Es ist bekannt, dass der Chemostat einen
Lage sind, bei einer gegebenen
ausüben kann. Diejenigen Zellen, die in der
sen, werden mit zunehmender
Substratkonzentration schneller zu wach
langsamer wachsenden Zellen
Expositionsdauer gefördert, während die
liessen, dass mit zunehmender
ausgewaschen werden. Es ist nicht auszusch
Eigenschaften unter den gegebenen
Expositionszeit Mutanten auftreten, deren
sen als die des Wildtyps. Eine
Bedingungen ein effektiveres Wachstum zulas
ter (1983) eine Idealisierung und
Isogenie der Chemostatzellen ist nach Berg
zu entsprechen.
scheint nicht den tatsächlichen Gegebenheiten
tsystem einer Alanin-limitierten
Collins et al. (1976) untersuchte das Transpor
von Alanin ist bei E. coli mit der
Chemostatkultur von E. coli. Die Aufnahme
k01Teliert. Nach zweimonatigem
gleichzeitigen Aufnahme eines Protons
ert werden, der vier Protonen pro
Chemostatwachstum konnte ein Stamm isoli
Chemostat mit diesem Stamm
Molekül Alanin transportierte. Wurde ein
nzentration, verglichen mit der
inokuliert, so wurde die limitierende Alaninko
unselektionierten Kultur, auf 1/20 gesenkt.
ostatkultur konnten Novick und
Mit Hilfe einer Lactose-limitierten Chem
titutiver ß-Galactosidase isolieren.
Horiuchi (1961) E. coli Stämme mit kons
), dass bei kleinen LactoseEs wird angenommen (Harder et al. 1977
ose den wachstumslimitierenden
konzentrationen die Hydrolyse von Lact
n induzierbarer Enzyme von der
Schritt bei E. coli darstellt. Da die Expressio
der Wildtyp bei tiefen LactoseInduktorkonzentration abhängig ist, wird
e synthetisieren, sodass die
konzentrationen nur wenig ß-Galactosidas
einen selektiven Vorteil besitzt.
Mutante mit konstitutiver ß-Galactosidase
ose-limitierten Chemostatkultur
Rutgers et al. (1987) stellten bei einer Gluc
dem Aufstarten des Chemostats
von Klebsiella pneumoniae fest, dass nach
ehe sich eine konstante Glucosebis zu 60 Volumenwechsel nötig waren,
ührte Batchexperimente mit
konzentration einstellte. Parallel durchgef
en eine synchrone Zunahme von
Inokulumzellen aus dem Chemostat zeigt
t
Glucosekonzentration, einen konstanten Wer
~nax. welches dann, analog zur
,
µmax
alleine die Steigerung von
annahm. Die Autoren folgerten, dass nicht
Affinitätskonstante zur Abnahme
sondern auch eine Zunahme der apparenten
ugen. Sie schlossen nicht aus, dass
der steady state Glucosekonzentration beitr
Mutationen dafür verantwortlich waren.
Wachstumsdauer eine Abnahme
Auch Höfle (1983) konnte mit zunehmender
imitierten Chemostatkultur von
der Glucosekonzentration bei einer Glucose-l
osekonzentration nahm stufenCytophaga johnsonae feststellen. Die Gluc
39
Konzentrationen unterweise ab, in deren Verlauf 5 verschiedene steady state
Batchkultur gemessene
schieden werden konnten; analog dazu nahm das in
he zu. Der Autor
Glucoseaufnahmepotential der Zellen um das 25-fac
im Chemostat der
dauer
folgerte, dass sich mit zunehmender Expositions
, möglicherweise
sserte
Glucoseaufnahmemechanismus der Kultur verbe
reguliert durch Mutanten.
die steady state Phasen
Wie in Figur 3.1 und 3.3 dokumentiert ist, wurden
sprunghaften Anstieg
einen
oftmals von Störungen unterbrochen, die durch
kterisiert waren. Da
chara
der Restkonzentrationen von Glucose und Fructose
rieben wurden, wird im
solche Störungen in der Literatur noch nicht besch
ologische Erklärung
folgenden Teil versucht, eine mechanistische und physi
für das Auftreten dieses Phänomens zu finden.
2.
WACH STUM S
STÖRP HASEN WÄHREND DES STEADY STATE
ellos die extrazelluläre
Das Charakteristische an diesen Störungen war zweif
mulation von Glucose
Akkumulation von Fructose. Während sich die Akku
olische Aktivität der
katab
im Medium durch eine temporär verminderte
Auftreten der Fructose
Zellen begründen lässt, ist eine Erklänmg für das
den erwähnt, konnte
schwieriger zu finden. Wie in Material und Metho
ostatkulturen gefunden
Fructose in fast allen Proben Glucose-limitierter Chem
-20 µg/l (siehe auch Fig.
werden, jedoch in der Regel nur in Spuren von 10
n, dass kleinere Mengen
werde
sen
2.7.a und 2.8). Es kann nicht ausgeschlos
ng entstanden sind
selösu
von Fructose während des Autoklavierens der Gluco
ollen des Reservoir(siehe Kapitel 2.4, Abschnitt 6). Periodische Kontr
aupt, nur in Spuren
mediums zeigten jedoch, dass Fructose, wenn überh
Erklärung für die bei
vorhanden war. Diese kleinen Mengen können keine
sein. Die höchste
tionen
zentra
sekon
den Störungen auftretenden hohen Fructo
eriode in einer
Messp
igen
Fructosekonzentration, die während der über 2-jähr
2.99 mg/l,
betrug
,
Glucose-limitierten Chemostatkultur gefunden wurde
1.49 mg/l etwa halb so
während die entsprechende Glucosekonzentration mit
Zeit bei D = 0.4 h-1
gross war. Diese Kultur wurde während längerer
chen mit dem steady
gehalten; die Glucosekonzentration nahm hier, vergli
höheren Wert an. 35
mal
state Wert bei dieser Verdünnungsrate, einen ca. 30
noch 41 µg/l und auch
Minuten später betrug die Glucosekonzentration nur
len steady state Wert
die Fructosekonzentration hatte wieder den norma
40
lauf einer Störung recht hohe Glucose
angenommen. Dies zeigt, dass im Ver
der
wurden, die jedoch schnell wie
und Fructosekonzentrationen erreicht
sePhänomen konnte auch bei Galacto
abklingen konnten. Das gleiche
hten
erhö
den
zu
h
tzlic
tet werden; zusä
limitierten Chemostatkulturen beobach
konnte hier in einigen Fällen auch
nen
ratio
Galactose- und Fructosekonzent
der
gewiesen werden. Der Einfluss
geringe Mengen von Glucose nach
im
ist nur klein und liegt wahrscheinlich
Störungen auf die Bakteriendichte
en; dies mag der Grund sein, weshalb
Schwankungsbereich solcher Messung
ben
Chemostat bisher noch nicht beschrie
solche nicht-steady state Phasen im
wurden.
er
ekannt. Alle kontrollierbaren Paramet
Die Ursache dieser Störungen ist unb
pH oder Mediurnszufuhrrate blieben
wie Temperatur, gelöster Sauerstoff,
erlei
unverändert. Die Tatsache, dass kein
vor, während und nach der Störung
ue
gena
die
rte
hwe
ung hinwiesen, ersc
Anzeichen auf eine kommende Stör
os
ifell
zwe
auffälligste Merkmal war
Untersuchung dieses Phänomens. Das
lle
que
ium. Da eine äussere Fructose
die Fructoseakkumulation im Med
die Bakterien selbst an der Fructose
ausgeschlossen werden kann, müssen
strat
lt in der Zelle weder als Speichersub
bildung beteiligt sein. Fructose spie
der
in
mt
kom
Ihr
sacchariden eine Rolle.
noch als Monomer bei Strukturpoly
um
i
dabe
Bedeutung zu. Es handelt sich
Zelle einzig als Phosphatester eine
hat
en Zuckerabbaus, Fructose-6-Phosp
wichtige Metaboliten des glykolytisch
h
Freie Fructose kann also nicht durc
(F6P) und Fructose-1,6-Diphosphat.
Um
ngen, wohl aber deren Phosphate.
Lyse von Zellen ins Medium gela
und
tose
Fruc
freie
Fructose wirklich als
sicher zu gehen, dass die gemessene
alzt
ents
sung
en hatte, wurde eine F6P-Lö
nicht als deren Phosphate vorgeleg
die
h
stellte sich heraus, dass F6P durc
und anschliessend analysiert. Es
dig aus der Probe entfernt wurde und
elektrodialytische Entsalzung vollstän
F6P
tand. Die Bildung von Fructose aus
dass keine freie Fructose dabei ents
den.
wer
en
loss
esch
kann demnach ausg
während der Probenaufbereitung
en
Glucose im Medium vorgelegen hatt
und
Damit ist klar, dass freie Fructose
usvora
tt
ein Dephosphorylierungsschri
und dass wenigstens bei der Fructose
ob
erimenten geht jedoch nicht hervor,
gegangen sein musste. Aus den Exp
. Beide Möglichkeiten sind denkbar.
dieser intra- oder extrazellulär erfolgte
41
1) extrazelluläre Dephosphorylierung
lysierte Zellen könnten
Hexosephosphate sind relativ labile Moleküle. Durch
und Phosphaten hydrosie ins Medium gelangen und zu freien Zuckern
e durch spezifische
lysieren. Die Hydrolyse von Hexosephosphaten könnt
leunigt worden
besch
gten,
gelan
Phosphatasen, die durch Zellyse ins Medium
sein.
2) Intrazelluläre Dephosphorylierung
verschiedenen ZellDie intrazelluläre Dephosphorylierung könnte in zwei
cytoplasmatische
die
kompartimenten stattgefunden haben, die durch
ischen Raum
asmat
peripl
Membran voneinander getrennt sind, nämlich a) im
und/oder b) im Cytoplasma selbst.
a) Dephosphorylierung im periplasmatischen Raum
die je nach ihrem pHDie E. coli Zelle besitzt verschiedene Phosphatasen,
teilt werden. Diese sind
Optimum in saure oder alkalische Phosphatasen einge
el et al. 1970).
reichlich im periplasmatischen Raum vorhanden (Wetz
s Spektrum phosbreite
ein
en
lysier
Die alkalischen Phosphatasen hydro
darin, die Zelle bei
allem
vor
t
phorylierter Substrate. Illre Bedeutung besteh
welches durch
rgen,
verso
Phosphatroangel mit anorganischem Phosphat zu
mt.
die Hydrolyse phosphathaltiger Substrate zustandekom
ese der alkalischen
Synth
die
wird
M
0.1
von
ration
Bei einer Phosphatkonzent
. In der vorliegenden
Phosphatasen fast vollständig eingestellt (Torriani 1960)
gearbeitet. Da diese
Arbeit wurde mit einer 0.02 M Phosphatkonzentration
m deckt, wird
weite
bei
Konzentration den Phosphatbedarf der Zellen
Synthese der
die
ion
angenommen, dass auch bei dieser Konzentrat
alkalischen Phosphatasen reprimiert ist.
Raum existiert eine
Unter den sauren Phosphatasen im periplasmatischen
sphaten ist; sie
sepho
Hexo
von
lyse
Phosphatase, die spezifisch für die Hydro
sphatase wird
sepho
Hexo
wird Hexosephosphatase genannt. Die Aktivität der
iegt aber
unterl
,
flusst
nur wenig durch den Phosphatgehalt im Medium beein
rtbare
verwe
e gut
der Katabolit-Repression durch Glucose und ander
wird sie auch in
Substrate (von Hofsten 1961). überraschenderweise
hosphat (von Hofsten
Gegenwart hoher Konzentrationen von Glucose-1-P
42
1961) und Glucose-6-Phosphat (Dvorak et al. 1967) reprimiert. Die Funktion
der periplasmatischen Hexosephosphatase ist noch unklar.
Die periplasmatische Dephosphorylierung von intrazellulären Hexosephosphaten bedingt eine vorhergehende Permeation der Hexosephosphate
durch die Cytoplasmamembran. Ein solcher Permeationsprozess konnte
erstmals bei einer E. coli Mutante mit defekter Phosphoglucose-Isomerase
und G6P-Dehydrogenase (pgi-, zwf-) nachgewiesen werden. Bei dieser
Mutante ist der Glucosemetabolismus sowohl über die Glykolyse als auch
über den Pentosephosphat-Weg blockiert. Fraenkel (1968a) inkubierte diese
Mutante in ein Glucose-haltiges Medium, wodurch sie innerhalb weniger
Minuten intrazellulär bis zu 60 mM Glucose-6-Phosphat (G6P) akkumulierte;
im Verlaufe des Experiments konnte der Autor extrazelluläres G6P im
Medium nachweisen, das anscheinend von der Zelle ausgeschieden worden
war.
Fraenkel et al. (1964) konnten zeigen, dass E. coli G6P ohne vorherige
Dephosphorylierung aufnehmen kann. Neben G6P werden auch andere
Hexosephosphate wie Fructose-6-Phosphat oder Mannose-6-Phosphat durch
das Hexosephosphat-Transportsystem aufgenommen. Dieses Transportsystem ist ein aktives Transportsystem und durch G6P induzierbar. Heppel
(1969) konnte zeigen, dass das Hexosephosphat-Transportsystem bei einer
pgi-,zwf--Mutante nicht durch Glucose induziert wird. Dies bedeutet, dass nur
extrazelluläres G6P als Induktor fungiert (exogene Induktion). Wurde der mit
G6P beladenen E. coli (pgi-,zwf-) Kultur 5.10-4 M G6P ins Medium
zugegeben, so wurde das Hexosephosphat-Transportsystem induziert. Dietz
und Heppel (1971) konnten zeigen, dass das induzierte HexosephosphatTransportsystem G6P gegen einen Konzentrationsgradienten bis zu 20: 1
(intra-:extrazellulär) akkumulieren kann; bei einem grösseren Verhältnis
scheidet die Zelle das überschüssige G6P durch das induzierte Hexosephosphat-Transportsystem aus.
Obwohl Glucose das Hexosephosphat-Transportsystem der pgi-,zwf--Mutante
nicht induzieren kann, ist eine indirekte Induktion durch Glucose möglich.
Dies konnte Winkler (1970) bei dichten, jedoch nicht bei verdünnten
Kulturen beobachten. Dieser Unterschied ist auf Exkretion von intrazellulär
akkumuliertem G6P zurückzuführen, welche bei dichten Kulturen
entsprechend grösser ist als bei dünnen. Da die Exkretion bei nicht
induziertem Hexosephosphat-Transportsystem geschieht, muss ein von
43
diesem unabhängiger Ausscheidungsmechanismus
Mechanismus ist unbekannt.
existieren.
Dieser
b) Dephosphorylierung im Cytoplasma
ulierten ZuckerEine cytoplasmatische Dephosphorylierung von akkum
beobachtet.
(1971)
Kepes
und
phosphaten wurde ersunals von Haguenauer
a-Methyl[14C]
von
g
Sie inkubierten Zellen von E. coli in einer Lösun
ortiert.
transp
glucosid (aMG). aMG wird von E. coli durch das Glucose-PTS
ogon handelt, akDa es sich um ein nicht-metabolisierbares Glucoseanal
-P). Wurden die
kumuliert es in der Zelle als [14C] aMG-Phosphat (aMG
so erschien
riert,
transfe
g
Lösun
aMGbeladenen Zellen dann in eine kalte
l konstant
P-Poo
aMG[14C] aMG im Medium. Da der totale intrazelluläre
aMG- P
tives
adioak
blieb, muss ein Teil des [14C] aMG-P durch nicht-r
intrazellulären
des
Austauschrate
Die
sein.
worden
ersetzt
entsprach dabei der
[14C] aMG- P durch nicht radioaktiv markiertes aMG
eine intrazelluläre
ierten
postul
n
initialen Aufnahmerate von aMG. Die Autore
einen Carrierund
hatase
Dephosphorylierung von aMG- P durch eine Phosp
(1985) wies
Saier
katalysierten Transport von freiem aMG aus der Zelle.
werden
iziert
jedoch darauf hin, dass bisher noch keine Enzyme identif
ysieren können.
konnten, welche cytoplasmatische Hexosephosphate hydrol
II (EU). Es kataDie eigentliche Permease des PT-Systems ist das Enzym
Phosphorylierung
r
lysiert die Aufnahme von Substraten unter gleichzeitige
III, welches
desselben. Als Phosphoryldonor fungiert in der Zelle das Enzym
Newman (1976)
die Phosphorylgruppe auf das Enzym II überträgt. Saier und
rien zeigen,
Bakte
n
iedene
versch
bei
und Saier et al. (1977) konnten in vitro
n. Dieser
könne
ren
fungie
dass auch Zuckerphosphate als Phosphoryldonoren
oben
Das
nt.
genan
Prozess wird Transphosphorylation (transphosphorylation)
ten,
vermu
lässt
beschriebene Experiment von Haguenauer und Kepes (1971)
stattfinden könnte
dass Transphosphorylation auch in der intakten Zelle
der vektoriellen
on
treakti
Gesam
Die
(vektorielle Transphosphorylation).
Substrat und
ndes
ortiere
Transphosphorylation für aMG als zu transp
[14C] aMG- P als Phosphoryldonor lautet:
EIIGlc
~---~ aMG-Pin + [14C] aMGout
44
Die Involvierung der vektoriellen Transphosphorylation in dem von
Haguenauer und Kepes (1971) beschriebenen Austauschprozess wird durch
die Tatsache erhärtet, dass die initiale Aufnahmerate von aMG identisch ist
mit der Austauschrate des [14C] aMG-Pools durch aMG-P. Dasselbe Phänomen konnten auch Postma und Roseman (1976) bei Salmonella typhimurium
beobachten.
Es gibt mehrere Hinweise, dass das Enzym II die Transphosphorylation
katalysiert. So konnte die Transphosphorylation bei Eil defekten Mutanten
nicht beobachtet werden und die Substratspezifität der Transphosphorylation
ist identisch mit derjenigen der Translokation.
Dies führte zur Vorstellung, dass das Enzym II zwei Kontaktstellen besitzt,
eine auf der Aussenseite der Membran für den Zucker und eine innerhalb für
das entsprechenden Zuckerphosphat. Unklar ist, wie der dephosphorylierte
Zucker durch die Membran nach aussen gelangt. Drei Möglichkeiten können
in Betracht gezogen werden: (i) Die Zucker diffundieren frei durch die
Zellmembran (ii) Die Zucker werden durch erleichterte Diffusion transportiert, z.B. durch Eil katalysiert (iii) Die Zucker werden durch aktiven
Transport freigesetzt.
Eine neuartige Transportregulation konnte bei Streptococcus-Arten gefunden
werden, die Inducer-Expulsion genannt wird (Reizer und Panos 1980).
Werden Zellen von S. pyogenes in ein Medium mit Methyl-ß-Thiogalactopyranosid (TMG) inkubiert, so akkumulieren sie dieses als Phosphatester (TMG-P) in der Zelle. Bei Zugabe von Glucose oder Mannose entledigt
sich die Zelle des akkumulierten TMG-P's durch einen Expulsionsmechanismus, wobei freies TMG ins Medium befördert wird. Der Expulsion muss also
ein Dephosphorylierungsschritt vorangegangen sein. Da die Ausscheidung
von TMG wesentlich schneller als die simultane Aufnahme von Glucose oder
Mannose war, kann die Transphosphorylation als Mechanismus der lnducerExpulsion ausgeschlossen werden. Der Name lnducer-Expulsion bezieht sich
auf die mögliche Bedeutung dieses Prozesses. Bei Streptococcus fungieren
die Zuckerphosphate, z.B. Galactose-6-Phosphat, als Induktor des lacOperons. Bei Verfügbarkeit eines besseren Substrates, z.B. Glucose, wird der
Induktor des lac-Operons ausgeschieden, was zu einer sofortigen Repression
des betreffenden katabolischen Enzyms führt. Die Inducer-Expulsion konnte
bisher noch bei keinem Gram-negativen Bakterium nachgewiesen werden.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die cytoplasmatische
Dephosphorylierung von Zuckerphosphaten sowie deren Ausscheidung als
45
freier Zucker ein bekrumtes Phänomen ist und in den Prozessen der
Transphosphorylation (wenigstens in vitro) sowie der Inducer-Expulsion
involviert ist. Über die Dephosphorylierung von glykolytischen Metaboliten
wurde jedoch in der Literatur noch nicht berichtet. Über den Mechanismus
der Dephosphorylierung und der Freisetzung der freien Zucker können
deshalb nur Vermutungen aufgestellt werden. Transphosphorylation der
Glucose durch Fructose-6-Phosphat könnte nicht über die EUGluc-, wohl aber
über die EIIMan-Permease, welche sowohl Fructose als auch Glucose transportiert, stattfinden.
Es scheint unwahrscheinlich, dass sich in einer Glucose-limitierten
Chemostatkultur gut verwertbare Substrate wie Glucose oder Fructose im
Medium akkumulieren. Man krum dies jedoch unter dem Gesichtspunkt der
Regulation des intrazellulären Zuckerphosphat-Pools betrachten. Es ist
bekannt, dass intrazellulär akkumulierte Zuckerphosphate lethal für die
Zellen sind (Cozzarelli et al. 1965, Bock und Neidhardt 1966, Fraenkel
1968a). Kaback (1969) konnte aufgrund seiner Arbeiten mit Membranvesikeln .· zeigen, dass intrazelluläre Hexosephosphate ausserdem eine
regulierende Funktion auf den Transportprozess ausüben können. Er
beobachtete die Glucoseaufnahme in Gegenwart verschiedener Hexosephosphate. G6P und G lP waren starke Inhibitoren des Glucosetransports,
während andere, z.B. F6P weniger effektiv waren. Dietzler at al. (1974)
konnten einen direkten Zusammenhang zwischen der intrazellulären G6PKonzentration und der Glucoseverwertungsrate bei einer Stickstoff-limitierten E. coli-Kultur beobachten. Durch die Zugabe verschiedener Konzentrationen von 2,4-Dinitrophenol konnte die Glucoseverwertung stimuliert
werden, was zu einer gleichzeitigen Verringerung des internen G6P-Pools
(und damit auch des F6P-Pools) führte. Kornberg (1973) konnte an einer E.
coli Mutante mit defekter Phosphoglucose-Isomerase und konstitutivem
Hexosephosphat-Aufnahmesystem die direkte inhibitorische Wirkung von
intrazellulärem G6P auf den Fructosetransport zeigen. Wildtypzellen, die auf
Fructose wuchsen, stellten ihr Wachstum sofort ein, wenn ihnen aMG
zugegeben wurde. Diese Inhibition war reversibel; wurde der phosphorylierte
Glucoseanalog ausgewaschen, so wuchs E. coli wieder normal auf Fructose.
Diese Befunde zeigen die grosse Bedeutung der Hexosephosphate für die
Regulation des zellulären Stoffwechsels. Ein hypothetisch angenommener
zellulärer Ausscheidungsmechanismus könnte deshalb über den Hexosephosphat-Pool die Transportaktivität kontrollieren und zugleich eine
46
hosphaten in toxischen Konzentraintrazelluläre Akkumulation von Hexosep
lation könnte dadurch zustande
tionen verhindern. Eine solche Akkumu
ert und phosphoryliert wird als die
kommen, dass mehr Glucose transporti
zeitweilige Blockierung eines im
Zelle zu katabolisieren vennag. Eine
te ebenfalls zu einer Akkumulation
Glucoseabbau involvierten Enzyms könn
boliten) führen.
von Hexosephosphaten (und anderen Meta
gsmechanismus auch während den
idun
sche
Es wird vermutet, dass dieser Aus
msphasen im Chemostat als zubalancierten, d.h. störungsfreien Wachstu
s wirksam ist. Hinweise dafür liefern
sätzliche Kontrolle des Metabolitenfluxe
die sowohl in Glucose- als auch in
die kleinen Fructosekonzentrationen,
n auftraten. Da in Galactose-limiGalactose-limitierten Chemostatkulture
zu den erhöhten Galactose- und
tierten Chemostatkulturen zusätzlich
n Glucose gefunden wurde, scheint
Fructosekonzentrationen in einigen Fälle
nismus für die Regulation des G6Pauch ein direkter Ausscheidungsmecha
Pools nicht ausgeschlossen zu sein.
ose- und Fructosekonzentrationen
Die Störungen mit erhöhten Gluc
Kuturen, sondern konnten auch in
beschränkten sich nicht nur auf E. colivon Candida boidinii gefunden
Glucose-limitierten Chemostatkulturen
ein im Protistenreich weitverbreitetes
werden; somit könnte es sich dabei um
Phänomen handeln.
d. Schlussfolgerung
igt, dass die Festlegung einer steady
Die Resultate dieses Kapitels haben geze
r konstanten äusseren Bedingungen
state Glucosekonzentration einer unte
mit Schwierigkeiten verbunden war.
wachsenden E. coli-Chemostatkultur oft
y state Glucosekonzentration dem
Definitionsgemäss entspricht die stead
deren Konzentrationen über längere
Mittelwert mehrerer Einzelmessungen,
ähnliche Konzentrationen besitzen.
Phasen (mindestens 10 Volumenwechsel)
ere Konzentrationsschwankungen
Eine solche Definition war nötig, da klein
en auftraten, die nicht mit dem
normal waren und verschiedentlich Phas
waren. So konnte in einigen Fällen
steady state Konzept zu vereinbaren
osekonzentration mit zunehmender
beobachtet werden, dass die Restgluc
utet, dass diese Abnahme durch
Kultivierungsdauer sank. Es wird verm
eren Wachstumseigenschaften als die
spontan auftretende Mutanten mit bess
ungen, die sich durch eine extrader Wildtypzelle zustandekam. Die Stör
und Fructose äusserten, lassen auf
zelluläre Akkumulierung von Glucose
47
traten möglicherweise als
nicht-steady state Bedingungen schliessen und
Folge zellulärer Regulationsmechanismen auf.
48
KAP ITEL 3.2
Beziehung der Wachstumsrate zur limitierenden
GlucoseSubs tratk onze ntrat ion: s vs. D(µ) - Diagramm einer
coli
E.
von
r
kultu
limitierten Chem ostat
a. Einleitung
im Batchexperiment ist
Die zeitliche Zunahme einer Bakterienpopulation
und die momentanen
µ
rate
bestimmt durch die spezifische Wachstums
Bakterienkonzentration x:
dx/dt = µ X
(3.4)
einer exponentiellen
Die Auflösung dieser Differentialgleichung führt zu
Gleichung:
x=x 0 eµt
(3.5a)
oder bei explizitem µ
µ =ln x- lnx0 / (t-to)
=
(3.5b)
tet. Sind der Population
wobei x0 die Bakterienkonzentration bei t 0 bedeu
so nimmt µ einen konen,
gegeb
n
Bedingungen zu unbeschränktem W achstw
zifisch und gleich
artspe
n
stanten Wert an, der unter gegebenen Bedingunge
Die Population nimmt
der maximalen spezifischen Wachstumsrate ~ax ist.
nentielle Wachstumsdann gemäss Gleichung 3.5a exponentiell zu (expo
nstoffquelle total aufgephase). Ist, bedingt durch das Wachstum, die Kohle
und die Populationsnull
rate
braucht, so wird die spezifische Wachstums
). Zwischen der
Phase
näre
dichte nimmt einen konstanten Wert an (statio
eine Übergangsphase,
exponentiellen und der stationären Phase befindet sich
auf µ = 0 fällt. In
in der µ, parallel zur Abnahme des Substrats, von µmax
s zugeordnet werden
dieser Phase kann jedem µ eine Substratkonzentration
oder anders ausgedrückt, µ wird eine Funktion von s.
49
atisch untersuchte.
Monod (1942) war der erste, der diese Beziehung system
nden turbidometrisch
Dabei bestimmte er in einer Batchkultur in kurzen Abstä
die Wachstumsrate
die Populationsdichte, woraus sich nach Gleichung 3.5b
aktuelle SubstratDie
lässt.
des betreffenden Intervalls berechnen
der Bakterienrauch
atverb
konzentration lässt sich aus dem totalen Substr
population berechnen:
s = s0
-
[(x - x0 )/Y]
(3.6)
Intervalls, x0 und s0
wobei x die mittlere Bakteriendichte des betreffenden
Beginn des Batchdie Bakteriendichte resp. Substratkonzentration zu
über den ganzen
experiments bedeuten. Eine konstante Ausbeute Y
Verfahrens.
Wachstumszyklus ist Voraussetzung für die Gültigkeit dieses
Monod ein
kelte
entwic
aten
Result
nen
Aus den mittels dieser Methode erhalte
Beziehung
die
es
welch
ell,
Wachstumsmodell, das sogenannte Monod-Mod
folgende
durch
µ
te
des Restsubstrat s zur spezifischen Wachstumsra
Gleichung beschreibt:
µ
= µmax S / ( Ks + s)
(3.7)
apparente) Affinitätswobei "1tnax die maximale Wachstumsrate und K8 die (
entration, bei der
konstante bezeichnet. K8 bezeichnet diejenige Substratkonz
µ = µmax/2 ist.
enten Gleichung für
Gleichung 3.7 ist formal identisch mit der Michaelis-M
dar. Dies wirft die
bel
die Enzymkinetik und stellt eine rechtwinklige Hyper
schritt kontrolFrage auf, ob das Zellwachstum durch einen einzigen Enzym
1967). Monod (1949)
liert wird, die sog. "bottle neck reaction" (Ierusalimsky
ein.
selbst schätzte diese Situation als eher unwahrscheinlich
verschiedener SubDie Affinitätskonstante K8 ist sinnvoll für den Vergleich
werden. Sie ist
htet
strate und kann als apparente Affinitätskonstante betrac
fenden Substrats
zweifellos mit der Aktivität des für den Abbau des betref
verantwortlichen Enzymsystems verbunden.
Arbeitsgruppen das
Seit der Pionierarbeit von Mono d (1942) haben viele
ismen/SubstratOrgan
Monod-Modell mit unterschiedlichen Methoden und
Literatur erhältlichen
Kombinationen überprüft. In Tabelle 3.1 sind die in der
50
Substrataffinitäten für E. coli mit Glucose als limitierendes Substrat
zusammengefasst.
Aus der Tabelle 3.1 geht hervor, dass die K8-Werte grosse Unterschiede
aufweisen; so ist der von Schulze und Lipe ( 1964) gefundene K8-Wert ca.
1000 mal grösser als jener von Shehata und Marr (1971). Koch und Wang
(1982) stellten fest, dass diese Unterschiede wahrscheinlich weniger durch
die Verwendung verschiedenartiger Stämme zustande kamen als vielmehr
durch den unterschiedlichen physiologischen Zustand der Zellen sowie der
verwendeten Methode. Der physiologische Zustand der Zellen ist abhängig
von den vorhergehenden Wachstumsbedingungen. So konnten Koch und
Wang (1982) zeigen, dass es eine wesentliche Rolle spielt, ob das Inokulum
von einer langsam wachsenden Chemostatkultur oder einer schnell wachsenden Batchkultur stammte (s. Tab. 3.1).
In Tabelle 3.1 ist ersichtlich, dass der Grossteil der Substrataffinitäten nach
der von Monod (1942) entwickelten Methode im Batchverfahren ermittelt
wurde. Es ist offensichtlich, dass die Fonnulierung des Monod-Modells,
welche sich ausdrücklich auf steady state Bedingungen bezieht, und die
Methode, mittels der die Daten erhalten wurden, in einem Widerspruch
stehen. In einer wachsenden Batchkultur ändern sich die Wachstumsbedingungen kontinuierlich, sodass sich in keiner Phase ein steady state einstellen kann. Dieses Problem konnte teilweise gelöst werden, indem mit
kleineren Bakteriendichten gearbeitet wurde (z.B. Koch und Wang 1982);
damit liess sich die Substratabnahmerate in einem gewissen Zeitintervall im
Rahmen halten.
Eine Methode, die der kontinuierlichen Verfahrensweise sehr nahe kommt,
wandten Shehata und Marr (1971) an. Sie arbeiteten mit einer kleinen
Bakteriendichte und transferierten zusätzlich einen Teil der Biomasse
periodisch in frisches Medium bekannter Substratkonzentration; dadurch
nahm die Bakterienmasse nie so sehr zu, dass sich die initiale Substratkonzentration signifikant verändern konnte. Die Wachstumsrate wurde dann
konduktometrisch bestimmt. Diese Methode erfordert eine gründliche Reinigung aller für die Mediumszubereitung benutzten Glaswaren und des
destillierten Wassers, da vor allem bei tiefen Substratkonzentrationen das
bakterielle Wachstum durch kleinste Mengen organischer Fremdstoffe beeinflusst wird.
Tab. 3.1 Substrataffinität (Kg) von E. coli mit Glucose als limitierendem Substrat.
Organismu s
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli ML30 G
E.coliB/r
E.coli ML308
E.coli ML308
E.coli 7020
Kg (mg/l)
3.96
73 -79
8.0
0.068 (12.6)*
0.18
2.34**
0.11***
8.46 (46.8)*
j
µmax (h-1)
0.94
0.99
0.65
0.78
1.04
0.78
0.48
0.55
Temp. [0 C]
1
1
37
30
20
37
37
37
37
20
Autoren beschrieben Wachtumskurve mit zwei verschiedenen Kg-Werten
** Batch-gewachsenes Inokulum
*** Chemostat-gewachsenes Inokulum (> 1 Monat bei D=0.06 h-1)
k.A. =keine Angabe.
*
Methode
Batch
Chemostat
k. A.
Batch
Batch
Batch
Batch
Batch
Referenz
Monod 1942
Shulze und Lipe 1963
Jannasch 1968
Shehata und Marr 1971
von Meyenburg 1971
Koch und Wang 1982
Koch und Wang 1982
Ishida et al. 1982
1
52
Das am häufigsten verwendete Modell zur Beschreibung der µ-s-Beziehung
ist das Monod-Modell (GI. 3.7). Sechs Jahre vor Monod schlug Teissier
(1936a, b) ein Modell vor, das er rein empirisch entwickelte
dµ/ds = k (µmax - µ) (3.8a)
Dieser Ausdruck ist formal ähnlich einer chemischen Reaktion erster
Ordnung, wobei die Zunahme der Wachstumsrate proportional (~nax - µ) ist.
Damit wird ausgedrückt, dass der Einfluss einer Substratänderung um so
kleiner ist, je näher µ bei ~ax liegt. Die Integration dieser Gleichung ergibt
µ=µma x (1 - e-ks) (3.8b)
Es ist schwer nachzuvollziehen, warum sich das Monod-Modell und nicht
jenes von Teissier durchsetzen konnte, denn in vielen Fällen können die
experimentellen Daten ebensogut mit dem Teissier-Modell beschrieben
werden (s. Powell 1967). Ein Grund könnte sein, dass sich Monod's Modell
auf experimentelle Daten stützt und mit dem K8 -Wert eine Grösse eingeführt
wird, die den Vergleich mit anderen Substraten erlaubt.
Monod's Modell blieb jedoch in der Folge nicht von Kritik verschont. Es
waren vor allem zwei Punkte, die bemängelt wurden 1. die Form der Kurve
(rechtwinklige Hyperbel) ist zu starr und 2. das ~ax wird erst bei zu hohen
Substratkonzentrationen erreicht. Deshalb wurden neue Modelle vorgeschlagen, die in den meisten Fällen auf eine Modifikation des Monod-Modells
beruhten. Moser (1958) ersetzte die erste Potenz von s durch eine willkürliche
µ = µmax sr/(Kr+sr)
(3.9)
womit die Kurve flexibler wird. Diese Modifikation kann jedoch weder biologisch noch chemisch interpretiert werden und fand deshalb keine grosse
Beachtung.
Contois (1959) berücksichtigte in seinem Modell den Einfluss der
Populationsdichte. Dieses lautet:
µ = ~ax s/(Bx+s)
(3.10)
53
stumsparameter bezeichnet.
wobei x die Populationsdichte und B ein Wach
od-Gleichung, wird aber durch
Der Ausdruck B·x ist analog dem Ks der Mon
utet, dass ein von den Bakdie Populationsdichte beeinflusst. Contois verm
rodukt des Substratabbaus eine
terien in das Medium ausgeschiedenes Endp
sprozess haben könnte. Die
inhibitorische Wirkung auf den Wachstum
Abklärung dieser Frage steht noch offen.
e Powell (1967) ein System, in
In seiner theoretischen Arbeit untersucht
en
die Membran diffundier
welchem ein Substratmolekül zuerst durch
mreaktion in den Metabolismus
(permeieren) muss, ehe es durch eine Enzy
eingeschleust wird. Dieses Modell lautet:
µ=µmax s/(K+L+s)
(3.11)
ms; L ist identisch mit derK bezeichnet die Affinitätskonstante des Enzy
Diffusionsrate nicht mehr limijenigen Substratk.onzentration, bei der die
Hyperbel mit einer Asymptote
tierend ist. Die Gleichung repräsentiert eine
90° zu ihr; für L = 0 resultiert
parallel zur s-Achse und einer zweiten 45° bis
das Monod-Modell.
ik für Mikroorganismen wird sehr
Im Zusammenhang mit der Wachsturnkinet
m
(1905) beschrieb mit diese
oft das Blackman Modell erwähnt. Blackman
C02-Konzentration und der
Modell die Photosyntheserate in Funktion der
Enzymkinetik von MichaelisLichtintensität, und zwar zu einer Zeit, als die
die Wachstumskinetik lautet das
Menten noch unbekannt war. Übertragen auf
Blackman-Modell folgendermassen:
A:
B:
µ=k s
µ=µmax
falls s < µmax/k
falls s > µmax/k
(3.12a)
(3.12b)
tion 1. Ordnung; in diesem
Gleichung 3.12a beschreibt eine chemische Reak
s zu. Bei einer gewissen
Teil der Kurve nimmt µ proportional mit
abrupt in eine Reaktion nullter
Grenzsubstratk.onzentration geht die Kurve
ben ist. Dieses Verhalten kann
Ordnung über, welche durch Gleichung B gege
ert werden: Im tiefen
enzymkinetisch folgendermassen interpreti
m A die WachstumsKonzentrationsbereich kontrolliert ein Enzy
deutlich kleiner ist als die aller
geschwindigkeit, indem dessen Reaktionsrate
er Teil der Kurve kann mit
übrigen am Wachstum beteiligten Enzyme. Dies
54
ens
der Michaelis-Menten Kinetik beschrieben werden, in welcher, wenigst
ng
im Bereich s < Km, µ annähernd linear mit s zunimmt. Der abrupte Überga
bei
B,
Enzym
Enzym,
anderes
ein
zu µmax kommt dadurch zustande, dass
;
einer gewissen Metabolitenkonzentration seine maximale Aktivität erreicht
die
auf
mehr
eine weitere Steigerung von s hat deshalb keinen Einfluss
Wachstumsgeschwindigkeit.
sehr
Dabes et al. (1973) entwickelten ein Modell, das dem Powell's formal
setzung
Voraus
der
ähnlich ist. Gleich dem Blackrnan-Modell gingen sie von
tflux
aus, dass in einem linearen Stoffwechselweg zwei Enzyme den Substra
als
kontrollieren, indem sie deutlich kleinere Vorwärtsreaktionsraten haben
sind
Enzyme
beiden
Die
.
Enzyme
die übrigen am Wachstum beteiligten
erste
durch eine grosse Gleichgewichtskonstante voneinander getrennt. Das
, das
Anfang
am
Enzym, welches als reversibel angenommen wird, wird eher
ten
zweite, irreversible Enzym eher am Schluss der am Wachstum beteilig
viel
Enzyrnkette erwartet. Die Annahme, dass das Vmax des ersten Enzyms
im
Enzym
erste
das
dass
t,
bedeute
grösser ist als das des zweiten,
le
maxima
die
Enzym
Wesentlichen die Affinität zum Substrat und das zweite
bei
hier
werden
Wachstumsrate bestimmt. Ungleich dem Powell- Modell
l
höheren Substratkonzentrationen Abweichungen vom Monod-Model
erwartet.
Sowohl Shehata und Marr (1971) als auch Mason und Millis (1976) konnten
nicht
ihre Daten aus einer Glucose-limitierten E. coli- resp. Torulopsis-Kultur
vollständig mit dem Monod-Modell erklären. Sie beobachteten bei höheren
viel
Substratkonzentrationen eine signifikante Abweichung, indem µmax
und
Shehata
tiziert.
prognos
l
-Model
schneller erreicht wurde als vom Monod
den
arbeiten
parallel
mehr
Marr's Interpretation basierte auf zwei oder
Enzyme mit unterschiedlichen Substrataffinitäten.
n
µ = 1: [µmaxi s/(Ks i+S)]
'
'
i=l
(3.13)
Mason und Millis gingen davon aus, dass nur ein Enzym die Wachstumsrate
en
kontrolliert. Das bei höheren Substratkonzentrationen abweichende Verhalt
limierklärten sie mit einer chemische Reaktion l. Ordnung, die parallel zur
et.
tierenden Enzymreaktion stattfind
55
chstum nicht mehr
lysierten das mikrobielle Wa
ana
82)
(19
al.
et
ff
rho
ste
We
die Gesetze der
aktionen, sondern übertrugen
Re
r
che
atis
ym
enz
sis
Ba
auf der
Modell wird
amik auf die Zelle. In diesem
dyn
mo
her
ts-T
ich
gew
ich
Nicht-Gle
Anabolismus durch die
ten des Katabolismus und
angenommen, dass die Ra
dem Substrat und den
n Freien Energie zwischen
Differenzen der Gibb'sche
Gemäss dieser Beschrei2, etc.) bestimmt werden.
C0
e,
ass
om
(Bi
ten
duk
Pro
itierenden Substrathe Abhängigkeit der lim
isc
hm
arit
log
e
ein
d
wir
bung
chstumsrate erwartet.
konzentration von der Wa
ssetzung aus, dass die
delle gehen von der Vorau
Alle hier behandelten Mo
digkeit der Bakterien
n die Wachstumsgeschwin
atio
ntr
nze
tko
stra
Sub
e
ern
ext
h ist, stehen nur
e aus Tabelle 3.1 ersichtlic
Wi
t).
ehr
gek
um
er
(od
t
steuer
nen Modelle zur
lle Überprüfung der einzel
nte
me
eri
exp
die
für
ten
wenig Da
se aus Batchkulturen.
isten Fällen stammen die
Ve1fügung und in den me
den Einsatz des
ten verhinderten bisher
Analytische Schwierigkei
Forschung. Mit der in
eig der mikrobiologischen
Chemostaten in diesen Zw
glich, die WachstumsMethode war es jedoch mö
ten
tell
ges
vor
2.4
l
pite
Ka
Chemostaten zu
einem Glucose-limitierten
in
h
auc
i
col
E.
von
kinetik
sem Kapitel auch die
perimenten wurde in die
bestimmen. In weiteren Ex
interessierte vor allem,
kulturen bestimmt. Dabei
Wachstumskinetik in Batch
kontinuierlicher Vere Methodik (Batch- vs.
ob sich die unterschiedlich
Wachstumskinetik auswirkt.
fahrensweise) auch auf die
b. Resultate
steady state zu halten
Zellen über längere Zeit im
um
nt
me
tru
Ins
ale
ide
s
Da
anismen leicht durch
chstumsraten der Mikroorg
Wa
die
Da
at.
ost
em
Ch
ist der
n kann, ist der
Mediums bestimmt werde
n
nde
sse
flie
ein
des
ate
die Flussr
Ermittlung der µ(D)-s
erte Instrument für die
Chemostat das prädestini
entstand durch Mesrten Bedingungen. Figur 3.5
Beziehung unter kontrollie
einer im Chemostat
der limitierenden Glucose
ion
rat
ent
onz
stk
Re
der
g
sun
nnungsraten. Sie setzt
i bei verschiedenen Verdü
col
E.
von
r
ltu
Ku
nen
gehalte
ufen (G l-G 4)
, unabhängiger Chemostatlä
rer
hre
me
ten
unk
ssp
Me
sich aus
bole gekennzeichnet
3.5 durch verschiedene Sym
zusammen, die in Figur
h sind in Tabelle 3.2
rigem 95%-Vertrauensbereic
sind. Die Werte mit zugehö
den tiefen Verdüncosekonzentrationen bei
Glu
Die
st.
fas
nge
me
am
zus
halb schwer zu
ren oft sehr niedrig und des
wa
)
h-1
0
0.3
<
(D
n
ate
nungsr
56
bestimmen. Bei D =0.2 h-1 waren die Glucosekonzentrationen bei der Hälfte
der Proben unter oder nahe der Detektionslimite von ca. 10 µg/l. Hier wurde
aus 10 entsalzten Proben je 1 ml in einen 50 ml Rundkolben transferiert und
durch Rotationsevaporation unter milden Bedingungen (Temp < 40°C) 3x
aufkonzentriert. Diese Methode wurde anhand von 10 entsalzten Proben, die
bei einer Verdünnungsrate von D = 0.3 h-1 entnommen wurden, mit dem
Mittelwert der Einzelmessungen verglichen. Die Werte, 32 µg/l durch erstere
gegen 31 µg/l durch letztere Methode bestimmt, waren fast identisch.
1
.8
..c
...-1...-J
r--1
............
0
[!)[!) [!)
.6
llt
t.
[!)
[!)
*!]
[!)
[!)~
C!JX
.4
::t.
HI
.2
0
0
.2
.4
.6
.8
1
l!I
G1
llE
G2
X
G3
A
G4
1.2 1. 4 1.6
Glucose [mg/I]
Figur 3.5 Beziehung zwischen der Verdünnungsrate und der steady state Glucosekonzentration einer Glucose-limitierten Chemostatk:ultur von E. coli im
Chemostat. Die verschiedenen Symbole bezeichnen unabhängige
Chemostatläufe (G l-G4 ).
57
ntrationen (s) bei vers
Tab. 3.2 Steady state Glucosekonze
Verdünnungsraten (D)
s (µg /l)
D (h-1 )
0.2
0.21
0.3
0.3
0.4
0.4
0.49
0.5
0.56
0.59
0.6
0.6
0.65
0.65
0.68
0.69
0.7
0.71
0.74
0.75
0.76
0.76
0.8
0.84
0.88
--
*
**
,,
16.0
16.7
32.0
37.2
45.6
54.9
52.6
107.2
194.2
181.3
144.6
206.3
229.5
275.2
333.9
436.0
435.4
572.8
495.6
648.2
843.5
864.2
934.1
1234
1600
Versuch
G3
G4
G3
Gl
G3
G4
Gl
G3
Gl
Gl
Gl
G2
Gl
Gl
Gl
G3
G2
Gl
G4
Gl
G2
Gl
Gl
G2
(G5)
chiedenen
Proben*
10
10
10
4
8
8
3
6
3
6
3
9
3
4
4
8
11
7
16
3
8
3
3
10
1
95%-VB**
-
8.2
14.8
5.5
9.7
8.2
19.9
11.7
29.6
11.2
15.5
69.5
19.3
13.3
17.8
12.0
42.2
20.9
39.6
19.4
44.2
48.1
16.0
-
bezeichnet die Anzahl Proben Mittelwertes s wurde nach der Studentder 95%-Vertrauensbereich des
Ve1teilung berechnet
58
n
Damit sich die Zellen optimal an die Wachstumsbedingungen anpasse
Adapeine
ten
nungsra
Verdün
konnten, wurde ihnen bei den betreffenden
mintionszeit gewährt, die beim G 1-Lauf 20-30, bei den übrigen Läufen
en
begonn
destens 50 Volumenwechsel betrug, ehe mit den Messungen
beim
wurde. Im vorhergehenden Kapitel wurde der Gleichgewichtszustand
Es
erisiert.
charakt
stat
Chemo
im
coli
E.
von
Glucose-limitierten Wachstum
n
auftrete
ums
Wachst
cierten
unbalan
zeigte sich, dass verschiedentlich Phasen
erhöhte
durch
sich
und
konnten, die als Störungen bezeichnet wurden
nicht
Glucose- und Fructosewerte äusserten. Da es sich hier eindeutig um ein
zu
steady state Phänomen handelt, scheint es berechtigt, diese Werte nicht
en
berücksichtigen. Die durch den Mediumwechsel verursachten Störung
tens
mindes
l
wechse
Medium
ein
konnten leicht umgangen werden, indem auf
dem
10 Volumenwechsel abgewartet wurden. Pro Probenahme wurde
entnom
)
Chemostaten durchschnittlich ca. 10 ml Flüssigkeit (inkl. Vorlauf
renmen, was etwa 1 % des Gesamtvolumens entsprach. Der daraus resultie
den
n
zwische
indem
n,
getrage
ng
Rechnu
den allfälligen Störung wurde
wurde.
rtet
abgewa
el
nwechs
Volume
einzelnen Probenahmen mindestens 1.5
zwei
Auf diese Art konnte in der Regel keine Abweichungen zwischen
aufeinanderfolgenden Proben beobachtet werden.
sodass
Figur 3.5 ist in der für die Enzymkinetik üblichen Form dargestellt,
die
auf
(D)
ngigen
unabhä
die
e,
Absziss
die
die abhängigen Werte (s) auf
von
dem
mit
besser
Kurve
die
sich
Ordinate zu liegen kommen. Damit lässt
entell
Monod (1942) entwickelten Modell (Gl. 3.7) vergleichen. Der experim
D=
bei
sich
gefundene Wert von µmax betrug 0.9 h-1. Aus Figur 3.5 lässt
0.45 h-1 einen K8 - Wert von ca. 80 µg/1 ablesen.
teste
Gleichung 3.7 lässt sich auf verschiedene Artenlinearisieren. Die bekann
ung
Auftrag
rk
aver-Bu
Linewe
die
ist
und am häufigsten angewandte Variante
nen
gefunde
entell
(1/s vs. l/D). Sollte das Monod-Modell für die experim
aare
Wertep
genen
Daten Gültigkeit haben, so müssten die reziprok aufgetra
aus Figur 3.5 eine Gerade bilden. Dies wurde in Figur 3.6.a mit einer linearen
Regression überprüft. Die daraus errechneten kinetischen Parameter ergaben
ete
für K 8 einen Wert von 46.5 µg/1 und für ~ax 0.77 h-1. Der so berechn
von
Wert
nen
gefunde
entell
µmax-Wert stimmt jedoch nicht mit dem experim
hohen
0.9 h-1 überein. Eine genauere Analyse von Figur 3.6.a zeigt, dass die
Der
Substratkonzentrationen nur schlecht durch die Gerade erfasst werden.
traLineweaver-Burk Plot hat den Nachteil, dass die tiefen Substratkonzen
der
in
letztere
obwohl
,
höheren
die
als
tionen viel stärker gewichtet werden
andere
eine
Vorteil,
von
oft
Regel genauer zu bestimmen sind. Deshalb ist es
59
6
/
/
4
61!('
/
/
/
/
/
l!I l!I /
0
...........
/
/
/
~Cl
2
/
!}-
Cl
a
0
.02
0
.06
.04
.08
1/Glucose
1
)(
.8 -
)(
>sc,.
"*x
)()(
.6 -
"")(
)(
0
)(
)(
.4 -
)(
)(
)(
)(
l!
.2 -
0
0
b
1
5
1
10
1
15
20
D/s
ur 3.5.
die
; Y-Achse: h. ----bezeichnet
/l)-1
chse: (mg
a) Lineweaver-Burk Plot. X-A
Regressions gerade.
: (mg!l.h)-1; Y-Achse: h-1.
b) Eadie-Hofstee Plot. X-Achse
rte aus Fig
Figur 3.6 Linearisierung der We
60
Linearisierungsart zu wählen, beispielsweise den Eadie-Hofstee Plot (Fig.
3.6.b), woµ gegen µ/s aufgetragen wird. Hier wird deutlich erkennbar, dass
die Werte keine lineare Beziehung beschreiben.
In Tabelle 3.1 konnte gezeigt werden, dass die meisten in der Literatur
dokumentierten µ - s Beziehungen nach der oben beschriebenen Methode von
Monod (1942) in Batchkulturen ermittelt wurden. Mit den folgenden Experimenten soll überprüft werden, ob sich die in Batchkulturen erhaltenen
Wachstumskurven mit solchen aus Chemostatkulturen vergleichen lassen. In
dieser Experimentserie wurde die Mediumzufuhr einer Glucose-limitierten
Chemostatkultur bei t = 0 abgestellt, wodurch die kontinuierliche Kultur in
eine Batchkultur überführt wurde. Die kontinuierliche Kultur wurde
vorgängig über mehrere Volumenwechsel im Chemostat gehalten, sodass die
Zellen optimal an diese Verhältnisse adaptiert waren. Durch das Abstellen
der Mediumzufuhr wurde die Restglucosekonzentration der kontinuierlichen
Kultur zur Initialglucosekonzentration der Batchkultur.
In Figur 3.7 ist die zeitliche Abnalune der Glucose aufgetragen, wobei die
initiale Glucosekonzentration dem Restsubstrat der bei D = 0.88 h-1 gewachsenen kontinuierlichen Kultur entsprach (ca. 1.6 mg/l). Die Steigung m der
gestrichelten Geraden entspricht der (theoretischen) Substratverbrauchsrate
der Zellen (qs•X) unter der Annahme, dass die Batchkultur die Wachstumsrate
aus dem vorherigen steady state in kontinuierlicher Kultur beibehält. Diese
Steigung lässt sich folgendermassen berechnen:
wobei Sin die Eingangsglucosekonzentration des einfliessenden Mediums
(100 mg/1) und s die steady state Glucosekonzentration (1.6 mg/l bei D =0.88
h-1) bezeichnet. Die theoretische Glucoseverbrauchsrate beträgt demnach im
vorliegenden Beispiel 24 µg/1 sec. Die Daten aus Figur 3.7 zeigen, dass die
reelle Glucoseverwertungsrate bei hohen Glucosekonzentrationen (bis ca.
1 mg/l) etwa derjenigen der theoretisch errechneten entspricht. Bei tieferen
Glucosekonzentrationen wird die Kurve kontinuierlich flacher und nähert
sich asymptotisch der x-Achse. Ein ähnliches Verhalten konnte auch mit
Galactose als limitierendem Substrat festgestellt werden. Eine solche Kurvenform datf aus Gleichung 3.7 erwartet werden, wo eine Konzentrationsänderung des limitierenden Substrats bei hohen Konzentrationen (nahe bei
µmax) die Wachstumsrate viel weniger beeinflusst als bei tiefen.
61
,...--,
1. 6
1. 4
"011.2
E
1
Cl)
.8
Cf)
0
.6
ü
::J
.4
CJ
.2
0
L--1
\
\
\
\
\
\
0
20
40
60
80
100 120
Zeit [sec]
Figur 3.7 Zeitliche Abnahme der Glucosekonzentration (C!I) durch eine E. coliBatchkultur im Chemostat. Bei t = 0 wurde die Mediumszufuhr einer bei
D = 0.88 h-1 wachsenden Glucose-limitierten Chemostatkultur abgestellt,
sodass die kontinuierliche Kultur in eine Batchkultur überführt wurde. Die
steady state Glucosekonzentration der kontinuierlichen Kultur wird dadurch zur
initialen Glucosekonzentration der Batchkultur. ----bezeichnet den Verlauf der
Glucosekonzentration unter der Annahme, dass die Zellen die Wachstumsrate
der kontinuierlichen Kultur beibehalten würden.
62
ratverbrauch berechnet
Die spezifische Wachstumsrate kann aus dem Subst
werden; es gilt
µ = l/x (dx/dt)
(3.15)
Kultur bedeutet. Unter
wobei x die Bakteriendichte der kontinuierlichen
Annahme einer konstanten Ausbeute gilt ferner
Y = - dx/ds = x/sin-s "' x/sin
(3.16)
Aus Gleichung 3.15 und 3.16 folgt
µ = -1/sin. (ds/dt)
(3.17)
stumsrate der Bakterien
Mit dieser Gleichung lässt sich die spezifische Wach
me der Bakteriendichte
aus dem Substratverbrauch berechnen. Die Zunah
und konnte deshalb in
während des Batchwachstums betrug maximal 1.6%
der Beziehung ds/dt
nntnis
den Berechnungen vernachlässigt werden. In Unke
ssion über je 3
Regre
e
wurde in Figur 3.7 die Steigung As/At durch linear
zentration dieses InterMesspunkte ermittelt und der mittleren Substratkon
vs. µ ist in Figur 3.8
valles zugeordnet. Die so entstandene Beziehung s
das Monod-Modell
dargestellt. Diese Beziehung lässt sich gut durch
s abgeleitete ~ax­
darau
der
);
beschreiben (Korrelationskoeffizient r2 =0.996
ca. 1.5 mg/l sind
von
Wert von 1.71 h-1 und der entsprechende Ks-Wert
aus Figur 3.8 herausjedoch nicht realistisch und deshalb bedeutungslos. Die
von µma:x/2 besitzt
gelesene Glucosekonzentration, bei der µ den Wert
7 mal grösser als der("K8 "), beträgt hier etwa 500 µg/l und ist damit etwa
Figur 3.5
"K
elte
8 "-Wert aus
jenige in kontinuierlicher Verfahrensweise ermitt
hohen
en
ander
bei
auch
bei µmax/2. Experimente der gleichen Art wurden
n
hunge
Bezie
neten µ-s
Verdünnungsraten durchgeführt. Die daraus errech
3.8 überein.
stimmten zum Teil recht gut mit den Werten aus Figur
63
,---,
..c:
............
.,.---
'---'
::l.
1
.9
.8
.7
.6
.5
.4
.3
.2
.1
0
l!I
l!I
0
.4
.8
1. 2
Glucose [mg/1]
1. 6
hstumsrate(µ) und der limitierenden
Figur 3.8 Beziehung zwischen der Wac
hnet nach Werten aus Figur 3.7.
Glucosekonzentration in Batchkultur, berec
64
c. Disk ussi on
Ks-Wert zeigt ein Vergleich der ExDer Einfluss der Methodik auf den
3.8 dokumentiert sind. In Figur 3.5
perimente, die in den Figuren 3.5 und
n erst nach einer längeren Adaptionswurden die Restglucosekonzentratione
ngsrate bestimmt; der "K8 "-Wert
periode bei konstanter Verdünnu
g hier ca. 80 µg/l. Die Zellen des in
(Glucosekonzentration bei µmax/2) betru
ents waren optimal an die VerhältFigu r 3.7 dokumentierten Batchexperim
sten nicht in ein neues Wachstumsnisse des Chemostats angepasst und mus
keine Lagphase auftrat. Trotzdem
medium transferiert werden, sodass auch
500 µg/l hier ca 6 bis 7 mal grösser als
war der beobachtete "Ks "-Wert mit ca.
ise gefundene"K8 "-Wert. Die Unterjener in kontinuierlicher Verfahrenswe
hstumsrate zur Substratkonzentration
schiede in der Beziehung der Wac
dass den Zellen in Batchkultur nicht
kamen wahrscheinlich dadurch zustande,
ffenden Glucosekonzentrationen, die
genügend Zeit blieb, sich bei den betre
ale katabolische Struktur aufzubauen.
sich kontinuierlich änderten, eine optim
en limitierenden SubstratkonzentraDer Abbau wurde deshalb über den ganz
mstruktur betätigt, die den vorherigen
tionsbereich mit einer ähnlichen Enzy
en bei D =0.88 h-1 angepasst war. Es
kontinuierlichen Wachstumsbedingung
auch bei kleineren Bakteriendichten
wäre interessant, denselben Versuch
Bakteriendichte würde bewirken, dass
durchzuführen. Eine Erniedrigung der
e (s. GI. 3.11); dadurch hätten die
die Substratabnahme verlangsamt würd
hs L\s mehr Zeit, um sich an die
Zellen innerhalb eines Substratbereic
zu adaptieren. Dies hätte zur Folge,
betreffenden Substratkonzentrationen
Substrat verbessern würde, sodass
dass sich auch die Affinität der Zelle zum
erwarten wäre. Dies würde bedeuten,
eine Erniedrigung des "K8 "-Wertes zu
Wachstumskinetik von den Initialdass die in Batchkulturen ermittelte
auch der Zellen abhängig wäre.
konzentrationen sowohl des Substrats als
anhand von Linearisierungsverfahren
Im Resultatteil dieses Kapitels konnte
die experimentell gefundenen Werte
(Fig. 3.6.a und b) gezeigt werden, dass
l (Gl. 3.7) beschrieben werden. Als
nur schlecht durch das Monod-Model
erhaltene µmax-Wert (0.77 h-1) nicht
grösster Mangel erwies sich, dass der so
h-1 übereinstimmt. Dies ist in Figur
mit dem tatsächlichen Wer t von ca. 0.9
t man den experimentell gefundenen
3.9 (Kurve a) deutlich zu sehen. Setz
men die errechneten µ-Werte für den
µmax-Wert in Gleichung 3.7 ein, so kom
65
Substratbereich von 200 µg/l bis 1 mg/l höher zu liegen als die experimentell
bestimmten (Fig. 3.9, Kurve b).
1
,--,
..c
..--
............
L.....J
0
.9
.8
.7
b
a
.6
.5
.4
.3
.2
.1
0
0
.2
.4
.6
.8
1
1.2 1.4 1. 6
Glucose [mg/IJ
Figur 3.9 Modellierte Beziehung zwischen der Verdünnungsrate (D) und der
steady state Glucosekonzentration.
Kurve a : Monod-Modell (GI. 3.7).
Kurve b: Monod-Modell, wobei für µmax der experimentell gefundene Wert
(0.9 h-1) eingesetzt wurde.
l!I bezeichnen die Werte aus Figur 3.5.
66
r (GI.
Ähnlich wie beim Monod-Modell verhält es sich mit jenem von Teissie
eine
3.8b). indem die Linearisierung (s vs. In [~nax/(µmax - µ)]) auch hier
Figur
gekrümmte Kurve ergibt (Fig. 3.10). Dies bedeutet, dass die Daten aus
.
3.5 nur schlecht beschrieben werden
3
X
,..--,
,..--....
::::i
1
X
ro
X
2-
E
::::i
...........
..........
X
ro
E
X
X
XX
Xx<
1-
::::i
xx
c
X
'---'
X
*
)0(
X
X
X
~
0
0
1
.4
1
.8
1
1. 2
Glucose [mg/1]
1. 6
Figur 3.10 Linearisierung des Teissier-Modells (Gl. 3.8). Die steady state
Glucosekonzentrationen sind gegen den natürlichen Logarithmus von
[µmax/(µmax-µ) l aufgetragen.
die BedeuIn Kapitel 2.4 wurde der Filtrationsvorgang beschrieben und auf
it
tung einer schnellen Trennung der Zellen von der Kulturflüssigke
hingewiesen. Die in Tabelle 3.2 angegebenen Werte gehen von der Voraust
setzung aus, dass während des Filtrationsvorgangs kein weiteres Substra
tatden
gt
unbedin
nicht
jedoch
muss
abgebaut wird. Diese Vorstellung
n
sächlichen Gegebenheiten entsprechen. Es ist allerdings aus zwei Gründe
n
Filtratio
der
d
sehr schwierig, eine allfällige Substratabnahme währen
infiniabzuschätzen. Erstens muss die mittlere Filtrationsdauer tf für ein
67
und zweitens das Abbauvertesimal kleines Flüssigkeitspaket bekannt sein
Falls die Bakterien während der
halten der Bakterien während der Filtration.
Substrat abbauen wie während
Filtration in den ersten Sekunden gleich viel
sich die abgebaute Substratdes Chemostatwachstums (vgl. Fig. 3.7), so lässt
bestimmen. Die korrigierten
menge annähernd durch Gleichung 3.11
folgendermassen berechnen:
Substratkonzentrationen (s ') lassen sich dann
s'
=s + (tf D
Sin)
(3.18)
hung. Setzt man für tr 3 SeDadurch erhält man eine veränderte µ-s Bezie
das Monod-Modell einen ~ax­
kunden ein, so erhält man bei Anpassung an
dem gemessenen ~ax-Wert
unter
Wert von ca. 0.88 h-1, welcher nur wenig
gross, da die Filtrationszeit für
von 0.9 h-1 liegt. Dieser tf-Wert ist jedoch zu
Deshalb scheint eine mittlere
die ganze Probe maximal 3 Sekunden dauerte.
tischer Wert darzustellen; der
Filtrationszeit von 1.5 Sekunden ein realis
0.82 h-1 und ist damit deutlich
daraus modellierte µmax-Wert beträgt dann ca.
dass die Bakterien während der
unter dem tatsächlichen µmax· Die Annahme,
wie während des ChemostatFiltration gleiches Abbauverhalten zeigen
scheinlich: (i) Während der
wachstums, ist aus zwei Gründen nicht sehr wahr
gen ausgesetzt, die mit denen
Filtration sind die Zellen Wachstumsbedingun
ändern Parameter wie Temperades Chemostats nicht vergleichbar sind. So
derten Bedingungen könnte
tur, Partialdrücke von COz und Oz. Diese verän
Schock führen, deren Wirkung
bei den Bakterien zu einem metabolischen
mus äussern würde. (ii) Gleisich in einem stark verminderten Katabolis
ren in der Nähe des gesättigten
chung 3.18 ist wahrscheinlich nur für Kultu
bei kleinen SubstratSubstratkonzentrationbereichs gültig, denn
µ - s Beziehung eine kleinen
konzentrationen wird wegen der linearen
eren Abnahme der WachstumsSenkung des Restsubstrats eine ungleich gröss
bewirken als bei hohen.
rate und damit auch der Substratverwertungsrate
sich der Einfluss der Filtration
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass
nur schwer abschätzen lässt.
auf die gemessenen Substratkonzentrationen
yse die unkorrigierten Werte
Aus diesem Grunde wurde bei der weiteren Anal
dass sich diese nicht signifikant
aus Tabelle 3.2 verwendet, in der Annahme,
den.
von den in situ Werten im Chemostat unterschei
die Werte am ehesten durch
Der Eadie-Hofstee Plot (Fig. 3.6.b) zeigte, dass
ffen werden. Dies deutet
getro
zwei Geraden unterschiedlicher Steigung
68
darauf hin, dass die experimentell gefundenen Werte nicht über den ganzen
Substratbereich durch ein einziges ratenlimitierendes Enzym beschrieben
werden können. Dieselbe Beobachtung machten auch Shehata und Marr
(1971) für E. coli ML 30G mit Glucose als limitierendem Substrat. Das
Monod-Modell vermochte ihre Daten nur bei den tiefen Substratkonzentrationen zu erklären; das ~ hingegen wurde bei niedrigeren Konzentrationen erreicht, als dies das Monod-Modell prognostiziert. Sie erklärten
dieses Verhalten mit mehreren parallel arbeitenden Enzymen, welche sich
durch unterschiedliche Affinitäten auszeichnen (Gl. 3.13). Während bei den
tiefen Substratkonzentrationen nur das Enzym mit der höchsten Affinität
signifikant zur Reaktionsrate beisteuert, machen sich bei höheren
Substratkonzentrationen auch die niedrig-affinen Enzymsysteme bemerkbar.
Die Kurve a in Figur 3.11, die nach der Prozedur von Shehata und Marr
(1971) berechnet wurde, zeigt den Fall für zwei parallel arbeitende Enzymsysteme. Daraus wird ersichtlich, dass auch in diesem Fall die Wachstumsrate
bei den hohen Substratkonzentrationen zu wenig schnell ansteigt. In Tabelle
3.3 werden die in dieser Arbeit gefundenen kinetischen Wachstumsparameter
für zwei parallele Enzymprozesse mit jenen von Shehata und Marr verglichen.
des
Tab. 3.3 Wachstumsparameter von E. coli ML 30 mit Glucose als limitieren
Substrat für n = 2 Enzyme
Autoren
Vmax,l
(h-1)
Km,L
(µg/l)
Vmax,2
(h-1)
Km,2
(mg/l)
Shehata&Marr 1971
Diese Arbeit *
Diese Arbeit**
0.775
0.745
0.715
68
43.8
43
0.031
0.155
0.247
12.6
287
0.65
Berechnet nach
* Shehata und Marr (1971)
** Neal (1972)
Die ersten zwei Kolonnen der Tabelle 3.3 zeigen, dass die Parameter des
hochaffinen Enzyms (vmax,i. Km,I) durchaus vergleichbar sind, während sich
die des niedrig-affinen Enzyms beträchtlich unterscheiden. Der Grund dafür
69
Arbeit gemessene µmax mit
liegt wahrscheinlich darin, dass das in dieser
jenes von Shehata und Marr
0.9 h-1 um ca. 0.12 Einheiten höhe r liegt als
(1971).
,.--,
...c
...........
..--
'--'
0
1
.9
.8
.7
.6
.5
__ .... ---
. ...-j";·::.:1:;;.·!!::''-"~- " .. ,,,-:.:::: .. ~;;-······· .....
.. ···• ,_ \ c
.~/
·l
/
.4
.3
.2
.1
0
~
a
0
/0
.2
.4
.6
.8
1
1.2 1.4 1.6
Glu cos e [mg/1]
nnungsrate (D) und der
Figur 3.11 Modellierte Beziehung zwischen der Verdü
aus Figur 3.5.
steady state Glucosekonzentration. l!I bezeichnen Werte
Shehata
a nach Gl. 3.13, für n = 2 Enzyme; Prozedur nach
······ ····K urve
und Marr ( 1971)
Enzyme; Prozedur nach
- - Kurv e b nach Gl. 3.13, für n = 2
Neal (1972)
-Gleichgewichts-Thermo----- Kur ve c nach dem Modell aus der Nicht
dynamik..
für das System zweier parallel
Neal (1972) liefert die mathematische Lösung
dur errechneten Wachstumsarbeitender Enzyme. Die nach dieser Proze
entsprechende Kurve ist in
parameter finden sich in Tabelle 3.3 (Zeile 3); die
hren ergibt ein ~ax von ca.
Figur 3.11 (Kurve b) abgebildet. Dieses Verfa
70
zu sein. In Batchkultur erreichten die
0.96 h-1. Dieses ~ax scheint zu hoch
zwischen 0.82 h-1 und 0.88 h-1. Im
Zellen in der Regel einen J.4nax·Wert
gs war eine genaue Bestimmung des
Chemostat lag er etwas höher. Allerdin
durchzuführen, da bei den hohen
µmax -Wertes im Chemostat schwierig
en begannen, was Wandwachstum
Wachstumsraten die Zellen zu flockulier
zur Folge hatte.
extrem dünnen Bakterienkulturen
Shehata und Marr (1971) arbeiteten mit
Arbeit wurde durchwegs mit einer
( < 106 Zellen/rnl). In der vorliegenden
TG Biomasse gearbeitet, was einer
Zelldichte zwischen 45 und 50 mg/l
richt. Trotzdem waren die WachsZellzahl von 1-2 • 108 Zellen/ml entsp
vergleichbar, was vermuten lässt,
tumsparameter Km,l und vmax,l durchaus
Bakteriendichte sind; dies würde dem
dass diese Werte unabhängig von der
.
Contois-Modell (Gl. 3.10) widersprechen
Enzymreaktionen hat gezeigt, dass
Die Analyse der Daten auf der Ebene von
durch eine einzige ratenbestimmende
die Wachstumskinetik von E. coli nicht
Der Ansatz mit zwei oder mehr
Enzymreaktion erklärt werden kann.
bessere Resultate. Shehata und Marr
parallelen Prozessen lieferte hingegen
sich bei diesen Prozessen um
(1971) wiesen darauf hin, dass es
iedlichen Substrataffinitäten handeln
Aufnahmemechanismen mit untersch
Zelle für die meisten wichtigen
könnte. Tatsächlich besitzt die E. coli
Glucose wird hauptsächlich über das
Substrate mehr als ein Transportsystem.
e Transportsystem, aufgenommen.
EIIIGlcfEJIGlc-System, das hochaffin
PTS-Systeme, z.B. über das MannoseGlucose kann aber auch durch weitere
z.B. über die beiden GalactosePTS, und aktive Transportsysteme,
e Systeme haben jedoch im Vergleich
Permeasen, aufgenommen werden. Dies
em eine viel kleinere Affinität zu
zum Glucose-spezifischen Transportsyst
en Glucosetransport erst bei höheren
Glucose, sodass ihr Beitrag zum total
e. Diese Erklärungsmöglichkeit
Glucosekonzentrationen bemerkbar würd
port der geschwindigkeitslimitierende
setzt aber voraus, dass der Glucosetrans
Fall ist, konnte bis jetzt noch nicht
Schritt des Wachstums ist. Ob dies der
Komberg (1976) konnten bei zwei
schlüssig beantwortet werden. Herbert und
halb einer Verdünnungsrate von
unterschiedlichen E. coli-Stämmen ober
zwischen der in Transportassays
D = 0.2 h-1 eine enge Korrelation
der errechneten Glucoseverwertungsbestimmten Glucoseaufnahmerate und
Chemostatkultur finden. Die Autoren
rate von Glucose-limitierten Zellen in
der Glucose-Phosphotransferase der
folgerten daraus, dass die Aktivität
71
geschwindigkeitsbestimmende Schritt des Wachstumsprozesses ist. Die
Befunde von Hunter und Kornbt-rg (1979) weisen jedoch auf einen nichtratenlimitierenden Transport hin, da die gemessene Glucose-PTS-Ak:tivität
einer Glucose-limitierten E. coli-Chemostatkultur stets grösser war als
tatsächlich erforderlich. Auch Neijssel und Tempest (1976) sowie Neijssel et
al. (1977) schlossen aufgrund ihrer Experimente mit Glucose-limitierten
E. coli- oder Klebsiella aerogenes-Chemostatkulturen ein Transport-limitiertes Wachstum aus. Wurde diesen Kulturen nämlich zusätzlich Glucose
zugepulst, so nahm die spezifische Sauerstoffverbrauchsrate schlagartig zu,
was auf eine erhöhte Transportkapazität deutet. Diese Art von Experimenten
scheint jedoch nicht geeignet zu sein, um Aufschluss darüber zu erhalten, ob
bei der betreffenden Verdünnungsrate der Transportprozess limitierend ist
oder nicht. Eine Zunahme der Enzym- (Transport-) Aktivität darf nämlich bei
einer Zugabe des Edukts immer erwartet werden, solange sich die
Enzymaktivität nicht in der Nähe von Vmax befindet.
Die Interpretation der Wachstumskinetik auf der Ebene von
ratenbestimmenden Enzymen geht in allen Fällen von einer konstanten, µunabhängigen Enzymkonzentration aus. Dean (1972) und Matin (1979)
fassen einige Resultate der Literatur zusammen, welche den Einfluss der
Verdünnungsrate auf die Aktivität verschiedener Enzyme aufzeigen. Der Fall,
wo die Enzymaktivität über einen grossen Bereich der Verdünnungsrate
konstant blieb, war eher die Ausnahme. Deshalb scheint die generelle
Annahme eines konstanten Enzymlevels bei unterschiedlichen Verdünnungsraten unberechtigt zu sein.
Der thermodynamische Ansatz von Westerhoff et al. (1982), bei welchem die
Zelle als "black box" betrachtet wird, beschreibt das Wachstum der Zellen
aufgrund der Differenz der freien Energien zwischen dem Substrat und der
Produkte (Biomasse, C02, u.a.); diese Differenz ist die treibende Kraft des
Substratfluxes. Als Folge wird eine logarithmische Abhängigkeit der
Substratkonzentration von der Wachstumsrate erwartet. In Figur 3.12 wurden
die Restsubstratkonzentrationen aus der Chemostatkultur logarithmisch gegen
D aufgetragen. Man sieht, dass die Werte über den ganzen
Konzentrationsbereich durch die Regressionsgerade erfasst werden. Die
entsprechende D-s Beziehung ist in Figur 3.11 (Kurve c) abgebildet.
72
8
,r
/
X/
x/
x/
K
X
)11(/1<
6-
/X
/~
(f)
c
4-
2-
,1(
yx
~
/
v
0
0
/
/
*'
l
.2
/
~
/X
X
1
1
.4
X
D
.6
1
.8
1
NichtLinearisierung des Wachstumsmodells aus der
Figur 3.12
den
gegen
ist
srate
Gleichgewichts-Thermodynamik. Die Verdünnung
ragen.
zentrationen aufget
natürlichen Logarithmus der steady state Glucosekon
.
---- bezeichnet die Regressionsgerade
, dass die Kurve nicht
Die logarithmische Auftragung von s hat zur Folge
Wachstumsrate auch
die
durch den Koordinatenursprung führt, sodass
3.11 schneidet die
negative Werte annehmen kann. Die Kurve c in Figur
werden, dass das
Abszisse bei ca 3.5 µg/l. Dies kann so interpretiert
73
nance-Prozesse
Nullwa chstum verbunden mit Substratverbrauch auf Mainte
der Zelle zutiickzuführen sind.
E. coli-Kulturen
Shehat a und Marr (1971) konnten beobachten, dass ihre
kein stabiles
unterhalb einer steady state Glucosekonzentration von 18 µg/l
einer Substratsteady state- Wachs tum mehr aufrecht erhalten konnten. Bei
(was einem TG
konzentration von 1.8 µg/l und einer Zelldichte von 103/ml
r als den
wenige
um
n
pulatio
von ca. 10-4 µg/l entspricht) nahm die Zellpo
bei D =
n
ntratio
Konze
Faktor 2 zu. Auch eigene Versuche, die steady state
),
Monate
1.5
(ca.
0.1 h-1 zu ermitteln, scheiterten trotz langer Kultivationszeit
nicht
allerdings
da die Schwa nkunge n von s zu gross waren. Es ist
ts, welche
Substra
des
Zugabe
weise
tropfen
auszuschliessen, dass die
ienten
nsgrad
ntratio
Konze
zu
aten
insbesondere bei kleinen Verdünnungsr
führen kann, auf dieses Resultat Einfluss nahm.
74
KAP ITEL 3.3
Kohlenstoff·
Regulation des Zuck erab baus bei E. coli unte r
limi tiert en Verhältnissen
a. Einleitung
schen Zustand an die jeBakterien haben die Fähigkeit, ihren physiologi
he Variabilität innerhalb
weilige Situation anzupassen, wobei die phänotypisc
r, der den Zustand der Zellen
des Genotyps festgelegt ist. Ein wichtiger Fakto
Nährstoffen. In ihrer natürnachhaltig beeinflusst, ist die Verfügbarkeit von
in der Regel Nährstofflichen Umgebung ist das bakterielle Wachstum
he Bakterien die der
otrop
limitiert, wobei die üblichste Limitation für heter
amp 1983). Die
Veldk
und
Kohlenstoff- und Energiequelle darstellt (Konings
daher gross. In dieser SituaKonkurrenz um kohlenstoffhaltige Moleküle ist
systeme und katabolischen
tion ist es für die Zelle von Vorteil, die Aufnahme
Bereitschaft zu halten.
Enzyme möglichst vieler potentieller Substrate in
gungen eine möglichst
Bedin
enen
Die Zelle ist stets bestrebt, unter den gegeb
rat-gesättigten Bedingungen
hohe Wachstumsrate zu erreichen. Unter Subst
olit-Repression oder Inducerverhindern Regulationsmechanismen wie Katab
me, die nichts oder nur
Exclusion die Synthese vieler katabolischer Syste
Kap. 3.4). Deshalb werden
wenig zu einem schnellen Wachstum beitragen (s.
verschiedener Substrate
ahl
unter solchen Verhältnissen bei einer Ausw
Wachstumsrate zulassen.
vorzugsweise diejenigen verwertet, die eine hohe
gen als Folge von IndukUnter Substrat-limitierten Verhältnissen kann hinge
s Spektrum verschiedentions- und Derepressionsmechanismen ein ganze
n 1979).
artiger Substrate simultan verwertet werden (Mati
grossen Einfluss auf die
einen
Es ist bekannt, dass die W achsturnsrate
n hat. So kann die
Zusammensetzung und Physiologie der Zelle
Zellen vergleichsweise um
Ribosomenkonzentration bei schnellwachsenden
senden Zellen. Harder und
das Zehnfache höher sein als bei langsam wach
stumsraten ca. 20 % des
Dijkhuizen (1982) berechneten, dass bei hohen Wach
assoziiert sind, bei
ktion
gesamten Zellproteins mit der Ribosomenprodu
hohen Wachstumsbei
Da
niedrigen Wachstumsraten hingegen nur ca. 7 %.
inmaschinerie selbst verraten ein grosser Teil der Proteine für die Prote
bei der Produktion anderer
wendet wird, müssen sich die Organismen
75
Proteine einschränken. Der totale Proteingehalt der Zelle wird jedoch nur
wenig von der Wachstumsrate beeinflusst. Somit können bei tiefen
Wachstumsraten, wo prozentual weniger Proteine für die Proteinsynthese
gebraucht werden, Proteine in andere Funktionen eingesetzt werden. So ist
bekannt, dass eine bei tiefen Verdünnungsraten wachsende Chemostatkultur
prozentual mehr katabolische Enzyme besitzt als bei hohen. Dies kommt
einer Vergrösserung der apparenten Affinität zum Substrat gleich, sodass bei
kleinen Verdünnungsraten die kleinen Substratkonzentrationen effizienter
verwertet werden können.
In den Versuchen zu diesem Kapitel wurde das Abbauverhalten der Zellen
untersucht, wem1, ausgehend von einer Glucose-limitierten Chemostatkultur,
unterbruchslos auf einen anderen Zucker (Arabinose, Galactose, Mannose,
Fructose) geschaltet wurde. Von besonderem Interesse war, wie schnell sich
die Zellen an das neue Substrat adaptieren konnten. Standing et al. (1972)
untersuchten den Übergang von Glucose auf Xylose resp. Galactose und
umgekehrt in einer bei D = 0.1 h-1 wachsenden, Kohlenstoff-limitierten
Chemostatkultur von E. co/i bei einer Temperatur von 25°C. Nach der
Umstellung von Glucose auf Xylose oder Galactose wurde eine vorübergehende Abnahme der Populationsdichte, verbunden mit einer Xylose- resp.
Galactoseakkumulation im Medium beobachtet. Den neuen steady state
erreichten sie erst nach ca. 24 Stunden. Im umgekehrten Fall, wo von Xylose
oder Galactose auf Glucose geschaltet wurde, kom1ten die Autoren keine
Adaptionsphase feststellen.
b. Resultate
Eine Glucose-limitierte Chemostatkultur (Eingangsglucosekonzentration s0 =
100 mg/l) wurde während ca. 50 Volumenwechseln bei D =0.5 h-1 gehalten;
zum Zeitpunkt t = 0 wurde unterbruchslos von Glucose auf ein Medium mit
Arabinose (Fig. 3.13), Galactose (Fig. 3.14), Fructose (Fig. 3.15) oder Mannose (Fig. 3.16) gewechselt. Die gestrichelte Linie bezeichnet die
(theoretische) Einwaschkurve des entsprechenden Substrats bei einer Eingangskonzentration von 100 mg/l und einer Verdünnungsrate von D = 0.5 h-1
unter der Annahme, dass kein Substrat durch die Bakterien verbraucht wird.
Diese Kurve der Substratkonzentration berechnet sich nach folgender
Gleichung:
76
Sth
=s0 (1 - e-Dt)
(3.19)
die gemessenen AraFall der Arabinose (Fig. 3.13) waren
Minuten identisch mit den
binosekonzentrationen während den ersten 45
bedeutet, dass während dieser
theoretisch berechneten Konzentrationen; dies
en wurde. Dieses ExperiZeit keine (oder nur wenig) Arabinose aufgenomm
es zeigte sich, dass die anment diente zugleich als Kontrollexperiment;
zulässt.
gewandte Methodik eine recht genaue Analyse
Im
..--.
45
I
/ l!I
I l!I
...........
CJ)
E
'---'
Q)
30
ro
l!I
l!I
l!I
'
'''
'
f'
15
1..-
<{
0
l!I
l!I
''
111
rp'
0
c
l!I
'11
(/)
..0
l!I
0
l!I
l!I
60
120
180
Zei t
240 300
[min]
360
420
n (l!I) im Medium. Zum ZeitFigu r 3.13 Verlauf der Arabinoseakkumulatio
D = 0.5 h-1 wachsenden Glucosepunkt t = 0 wurde, ausgehend von einer bei
bruchslos auf Arabinose als
limitierten Chemostatk:ultur von E. coli unter
gewechselt. ---- bezeichnet die
einzige Kohlenstoff- und Energie-Quelle
inose bei D = 0.5 h-1. Die Eintheoretisch errechnete Einwaschkurve für Arab
mg/l.
gangssubstratk:onzentration betrug jeweils 100
77
se geschale, wenn von Glucose auf Galacto
Komplexer waren die Verhältniss
en 3 bis 5
erst
den
men die Zellen während
tet wurde (Fig. 3.14). Hier nah
ch einen
dur
Nach einer Lagphase, die
Minuten intensiv Galactose auf.
zur Einnen Galactosekonzentrationen
parallelen Anstieg der gemesse
der Galacannen die Zellen erneut mit
waschkurve erkennbar ist, beg
n dann nur
betrug die Galactosekonzentratio
toseaufnahme. Nach 3 Stunden
noch 0.32 mg/l.
,--,
............
(J'l
E
'--'
Q)
Cf)
0
-+-'
0
CU
CU
CJ
30
5
25
/
I
4
l!J l!Jl!J
3
l!J
/l!J
I
I
15
2
l!J
1
~
/l!J
I
I
/l!J
I
I
10
0
l!J!J
/~
20
5
l!J
I
/
0
I
I
I
I
2
I
I
/
I
I
I
I
/
I
I
4
6
8
l!J
1Bi
0
0
l!J
I
I
I
I
I
60
12 0
Ze it
18 0
24 0
30 0
[min]
. Zum Zeitseakkumulation ( [!]) im Medium
Figur 3.14 Verlauf der Galacto
Glucoseeiner bei D =0.5 h-1 wachsenden
punkt t =0 wurde, ausgehend von
se als
acto
Gal
auf
E. coli unterbruchslos
lirnitierten Chemostatkultur von
t zeigt
dran
Qua
-Quelle gewechselt. Der kleine
einzige Kohlenstoff- und Energie
uten.
ulation während den ersten Min
den Verlauf der Galactoseakkum
actose bei D =
Gal
für
urve
chk
chnete Einwas
---- bezeichnet die theoretisch erre
l.
nzentration betrug jeweils 100 mg/
0.5 h-1. Die Eingangssubstratko
78
Anders verhielten sich die Zellen nach dem Umschalten von Glucose auf
Fructose (Fig. 3.15). Hier wurde während den ersten Minuten nur wenig
Fructose aufgenommen. Die eigentliche Fructoseverwertung begann nach
etwa 10 Minuten. Die Mannose (Fig. 3.16) schliesslich wurde von Beginn
weg ohne Lagphase verwertet. Mannose als einzige Kohlenstoff-und Energiequelle scheint jedoch kein ideales Substrat für E. coli zu sein; nach ca. 40
Minuten setzte starke Flockenbildung ein, worauf die Mannosekonzentration
im Medium wieder zu steigen begann.
8
I
I
I
I
,.......,
...........
(J)
E
'--'
Q)
(/)
0
.........
ü
::J
1......
LL
6-
/ l!I
l!I
l!I
I
I
l!I
/1!1
I
I
I
l!l
420
l!I
I
I
I
lll
I
l!I
~
I
ID
I
„
0
1
10
1
20
1
30
Zeit
1
40
[min]
1
50
1
60
70
Figur 3.15 Verlauf der Fructoseakkumulation (l!I) im Medium. Zum Zeitpunkt
t = 0 wurde, ausgehend von einer bei D = 0.5 h-1 wachsenden Glucoselimitierten Chemostatkultur von E. coli unterbruchslos auf Fructose als einzige
Kohlenstoff- und Energie-Quelle gewechselt. ---- bezeichnet die theoretisch
enechnete Einwaschkurve für Fructose bei D = 0.5 h-1. Die Eingangssubstratkonzentration betrug jeweils 100 mg/1.
79
l!l
l!l
l!l
l!l
l!l
l!l
1
15
Zeit
1
30
45
[min]
. Zum ZeitFigur 3.16 Verlauf der Mannoseakkumulation ( Cl ) im Medium
Glucosenden
wachse
h-1
0.5
=
D
bei
einer
punkt t =0 wurde, ausgehend von
einzige
als
se
Manno
auf
uchslos
limitierten Chemostatkultur von E. coli unterbr
isch
theoret
die
net
Kohlenstoff- und Energie-Quelle gewechselt. ---- bezeich
gssubstraterrechnete Einwaschkurve für Mannose bei D = 0.5 h-1. Die Eingan
konzentration betrug jeweils 100 mg/l.
n Zucker hatte
Das unterb ruchlo se Umste llen von Glucos e auf einen andere
µg/l), die Restzur Folge, dass eine kleine Menge Glucos e (ca. 100
neu zugefü hrten
glucos ekonze ntratio n bei D = 0.5 h-1, zusam men mit dem
dann in der Regel
Substr at im Mediu m vorhan den war. Die Glucos e wurde
d dieses kurzen
währen
sodass
ut,
innerh alb der nächst en 1 - 2 Minute n abgeba
Zeitrau mes Mischs ubstrat verhält nisse vorlage n.
80
c. Diskussion
E. coli Mutante ohne
Novotny und Englesberg (1966) konnten bei einer
nosetransport ein
Arabinoseisomerase-Aktivität zeigen, dass der Arabi
te akkumulierten
Mutan
dieser
induzierbarer Prozess ist. Induzierte Zellen
g TG Biomasse
pro
intrazellulär innert drei Minuten bis zu 34 mg Arabinose
erin) und 13.5 mg in
in Gegenwart einer Kohlenstoff-und Energiequelle (Glyc
akkumulierten keine
deren Abwesenheit. Nicht induzierte Zellen hingegen
Akkumulationsprozess
Arabinose, woraus die Autoren schlossen, dass der
ersuch von Fig. 3.13
ostatv
durch L-Arabinose induziert wird. Der Chem
Glucose-limitierten
bestätigt diese Beobachtung und zeigt, dass in einer
spezifischen TransportChemostatkultur bei D = 0.5 h-1 beide Arabinose, denn bei induziertem
systeme, AraE- und AraF-Permease, nicht aktiv waren
ulieren. Eine intraTransport würde die Zelle intrazellulär Arabinose akkum
Biomasse würde
TG
g
pro
mg
zelluläre Arabinoseakkumulation von ca. 20
tration von
onzen
nosek
im Chemostat eine Senkung der extrazellulären Arabi
en waren
tration
onzen
ca. 1 mg/l bewirken. Die gemessenen Arabinosek
hneten Werten der
jedoch während den ersten 45 Minuten mit den berec
erwertung konnte nach
Einwaschkurve identisch. Eine deutliche Arabinosev
45 Minuten beobachtet
nach
erst
der Umstellung von Glucose auf Arabinose
die Arabinose-spezilich
werden. In dieser Zeitspanne wurden wahrschein
fischen Transport- und Abbausysteme synthetisiert.
Permease besitzt die
Analog zur niedrig-affinen AraE- und hochaffinen AraFeme, nämlich die
rtsyst
anspo
E. coli Zelle zwei spezifische Galactosetr
ffine ß-Methylhocha
niedrig-affine Galactose-Permease (GalP) und die
1965). Neben diesen
galactosid-Permease (MglP) (Ganesan und Rotman
noch mindestens vier
beiden Transportsystemen besitzt die E. coli Zelle
so kann Galactose
weitere Aufnahmesysteme mit Affinität zu Galactose;
durch die TMGsowie
sen
ebenfalls durch die beiden Arabinosepermea
in unveränderter
wird
Permeasen 1 und II in die Zelle gelangen. Galactose
Galactosekatabolismus
Form in die Zelle transportiert. Den ersten Schritt des
lung phosphoryliert.
führt die Galactokinase aus, welche Galactose in 1-Stel
n der Galactose-1Galactose-1-Phosphat wird durch die kombinierte Aktio
alactose-4-Epimerase
Phosphat Uridyltransferase und Uridindiphosphog
drei Enzyme (Galschliesslich zu Glucose-1-Phosphat überführt; diese
tose induziert.
Enzyme) werden koordiniert durch intrazelluläre Galac
81
ort bei E.
die ersten, die den Galactosetransp
Horecker at al. (1960 a, b) waren
igen zu
läss
ach
fluss des Metabolismus vern
coli untersuchten. Um den Ein
(galK).
e
galactokinaselose E. coli Mutant
können, verwendeten sie eine
t, so
galactosehaltigen Medium inkubier
Wurde diese Mutante in einem
der
actose pro g TG Biomasse, während
akkumulierte sie bis zu 60 mg Gal
se
acto
Gal
e
sbar
mes
ML 30, keine
entsprechende Wildtyp, E. coli
e
tant
Mu
galK
hied zum Wildtyp zeigte die
akkumulierte. Als weiterer Untersc
ne
oge
end
h
, welche wahrscheinlich durc
konstitutive Transporteigenschaften
en, dass
und Kalckar (1966) konnten zeig
Induktion zustande kommt. Wu
ool aufeinen intrazellulären Galactose-P
galK Mutanten in jedem Medium
von
ung
eug
Erz
re
lulä
r ist die intrazel
bauen können. Verantwortlich dafü
der
und
e
zym
-En
Weg. So werden die Gai
Galactose über den UDP-Hexose
r
ode
ase
mer
en mit defekter UDPGal-4-Epi
Galactosetransport in galK Mutant
se
acto
h Zugabe von extrazellulärer Gal
UDPG-Pyrophosphorylase erst nac
rons bei
konstitutive Expression des gal Ope
induziert. Des weitem ist für die
et al.
(Wu
ng
etzu
auss
Mgl-Permease Vor
galK Mutanten eine funktionierende
aus
s
ktor
Indu
n
ugte
n des intrazellulär erze
1969, Wu 1967), was das Austrete
der Zelle verhindert.
tatverFigur 3.14 dokumentierten Chemos
Die Galactoseverwertung des in
die ca. 5
rteilt werden. In der ersten Phase,
suchs konnte in drei Phasen unte
Medium
Zellen intensiv Galactose aus dem
Minuten dauerte, wurde von den
ein voll
auf
was
se),
actose/g TG Biomas
aufgenommen (total ca. 30 mg Gal
Lagen
end
folg
em deutet. In der darauf
induziertes Galactose-Transportsyst
meno
aufg
entweder keine Galactose mehr
phase von ca. 20 Minuten wurde
die
ch
ist, die Galactoseaufnahmerate (dur
men oder, was wahrscheinlicher
hen
ifisc
spez
n
eine
ch
scheidungsrate (dur
Mgl-Permease) entsprach der Aus
um
chst
Wa
he
ntlic
iesslich begann das eige
Carrier). In der dritten Phase schl
aextr
der
e
ahm
sich in einer schnellen Abn
der Zellen auf Galactose, welches
hte
ndic
terie
und der Zunahme der Bak
zellulären Galactosekonzentration
äusserte.
jener der
sen hatte grosse Ähnlichkeit mit
Die Kinetik der ersten zwei Pha
Situation
Die
a).
0
von Horecker et al. (196
oben beschriebenen galK-Kultur
hbar mit
leic
verg
-Enzymen ist durchaus
des Wildtyps mit reprimierten Gai
rend der
wäh
liegt deshalb nahe, dass die
jener der galK Mutante. Der Schluss
nur
actose nicht katabolisiert, sondern
ersten Phase aufgenommene Gal
actose
-Enzyme durch intrazelluläre Gal
akkumuliert wurde. Da die Gai
h ca. 30
Induktion der Gai-Enzyme und nac
induziert werden, führte dies zur
Minuten zur Galactoseverwertung.
82
Wie bei der galK Mutante könnte die Konstitutivität des Galactosetransports
in der Glucose-limitierten Chemostatkultur durch das endogen induzierte
Mgl-Transportsystem hervorgerufen worden sein. Eine andere Möglichkeit
wäre, dass Spuren von Galactose im Medium genügen, um das MglTransportsystem zu induzieren. In einigen Chromatogrammen Glucoselimitierter Chemostatkulturen traten Peaks auf, die aufgrund der Retentionszeiten auf Galactose schliessen lassen (s. Fig. 2.8).
Die Mgl-Permease und die Gai-Enzyme sind auf verschiedenen Operons
lokalisiert, sodass die Regulation unabhängig voneinander ist. Anscheinend
muss die intrazelluläre Galactosekonzentration, welche zur Induktion der
Gai-Enzyme nötig ist, höher sein als für die Mgl-Permease. Der in Figur 3.14
dargestellt Versuch, wurde insgesamt 5 mal durchgeführt. Nur in einem Fall
wurde die Galactose von Beginn weg ohne anschliessende Lagphase
verwertet; offensichtlich waren zu jenem Zeitpunkt die Gai-Enzyme
induziert. Der Grund dafür ist unbekannt.
Es ist nicht klar, weshalb die Zellen ein vollinduziertes Galactose-Aufnahmesystem besitzen, die aufgenommene Galactose jedoch in der Regel
nicht verwerten können. Eine mögliche Erklärung wäre, dass die MglPermease während des Glucose-limitierten Chemostatwachstums im Glucosetransport involviert ist.
Die steady state Glucosekonzentration, die bei D = 0.5 h-1 ca. 100 µg/l betrug
(s. Kap. 3.2), schien keinen Einfluss auf die Aufnahmekinetik der Galactose
zu haben; wurde zwischen der Glucose- und Galactosezufuhr ein Unterbruch
von 2 Minuten eingeschaltet, so konnte bezüglich der Galactose-Aufnahmekinetik kein Unterschied festgestellt werden.
Obwohl neben der Mgl-Permease noch mindestens 5 weitere Transportsysteme Galactose aufnehmen können, scheint die Involvierung der MglPermease ausser Zweifel zu stehen. Die Gal-Permease akkumuliert Galactose
in der Grössenordnung von 1 mg/g TG Biomasse (Komberg und Riordan
1976) und konnte somit für die ca. 30-fach höhere Akkumulation nicht
verantwortlich sein. Wie aus Figur 3.13 hervorgeht, sind beide Arabinosetransportsysteme reprimiert. Auch die TMG 11-Permease kann für die
beobachtete Galactoseakkumulation nicht verantwortlich sein, da sie im MLStamm nicht nachweisbar ist (Prestidge und Pardee 1965). Eine Beteiligung
der TMG-Permease 1 kann jedoch nicht ausgeschlossen werden.
Der Chemostatversuch von Figur 3.15, in welchem von Glucose auf Fructose
geschaltet wurde, zeigt, dass die Fructoseverwertung unter Glucoselimitation
ein induzierbarer Vorgang ist. Figur 3.17 zeigt den Verlauf der spezifischen
83
Fructoseaufnahmerate (mg Fructose verwertet/ min. 45 mg TG Biomasse),
wobei die Werte aus zwei verschiedenen Experimenten stammen. Daraus
wird ersichtlich, dass während den ersten 30 Sekunden nur wenig Fructose
aufgenommen wurde. Während den nächsten 3 Minuten fällt dann die spezifische Fructoseverwertungsrate gegen null. Danach nimmt sie linear zu, um
bei ca. 15 Minuten ein Maximum zu erreichen. Fructose wird hauptsächlich
durch das Fructose-spezifische Phosphotransferase-System transportiert,
wodurch Fructose in 1-Stellung phosphoryliert wird (Fraenkel 1968 b). Die
Eilfrnc-Permease wird durch Wachstum auf Fructose induziert und weist bei
Wachstum auf Glucose nur minimale Aktivität auf. Der folgende Schritt, wo
Fructose-1-Phosphat in Fructose-1,6- Diphosphat überführt wird, wird von
der Fructose-1-Phosphat Kinase katalysiert, welche induzierbar ist und bei
Wachstum auf Glucose nur minimale Aktivität aufweist (Fraenkel 1968b). Es
scheint möglich, dass die Inhibition des Fructoseabbaus zu Beginn des Experiments auf fehlende Aktivität der Fructose-Permease und/oder der
Fructose-1-Phosphat Kinase zurückzuführen ist.
Q)
.......
800
ro
t.....
cn
Cl
c:: ,.......
:::::J (.!)
t
Q)
;:
°'
E
400
*
200
t..... LO
Q) ~
>
Q)
cn
.........
C)
0 ..3
.......
(.)
:::::J
t.....
u_
600
1-
0
0
10
20
30
40
50
60
Zeit [min]
Figur 3.17
Fructoseverwertungsrate einer Kohlenstoff- und Energielimitierten E. co/i-Chemostatkultur, nachdem zum Zeitpunkt t =0 von Glucose
auf Fructose gewechselt wurde. Werte stammen aus zwei unabhängigen
Experimenten.
84
Mannose ist wie die Fructose ein PTS-Zucker. Figur 3.16 zeigt, dass
Mannose von Beginn weg verwertet wurde. Mannose gelangt ausschliesslich
über die EUMan-Pennease als Mannose-6-Phosphat in die E. coli Zelle.
Mannose-6-Phosphat wird dann durch die Mannosephosphat-lsomerase in
Fructose-6-Phosphat überlührt und so in den glykolytischen Abbauweg
eingeschleust. Kornberg und Reeves (1972) konnten zeigen, dass bei einigen,
aber nicht allen E.coli-Stämmen, das Mannose-PTS konstitutiv gebildet wird.
Da ausserdem ein kleinerer Teil der Glucose während des Glucose-limitierten
Wachstums durch die EUMan-Pennease transportiert wird, ist diese Pennease
auch in Abwesenheit von Mannose induziert. Ebenfalls aktiv in Abwesenheit
von Mannose ist die Mannosephosphat-Isomerase, da sie eine wichtige Rolle
im Aufbau von Zellwand-Polysacchariden spielt (Lin 1987). Aus diesem
Grund ist es nicht überraschend, dass die Mannose nach Umstellen von
Glucose auf Mannose unterbruchslos verwertet werden kann. In Figur 3.18 ist
die spezifische Mannoseverwertungsrate nach dem Umstellen von Glucose
auf Mannose dokumentiert. Diese erreicht nach ca. 10 Minuten den Maximalwert und bleibt dann für ca. 1/2 Stunde konstant; danach setzt starke Flockenbildung ein verbunden mit der Auswaschung der Zellen sowie Zunahme der
Mannosekonzentration des Mediums. Der Grund dafür ist unbekannt.
700
Q)
+-'
CO
'-
l!I
600
(f)
Ol
c: ,......., 500
::J (!)
+-' 1'Q)
Cl
!: E
'Q)
lO
>
Q) ""'"
*
'
c: a
c:
(/)
0
CO
~
Cl
400
300
200
100
0
0
5
10
15 20
25 30
35 40
Zeit [min]
Mannoseverwertungsrate einer Kohlenstoff- und EnergieFigur 3.18
limitierten E. coli-Chemostatkultur, nachdem zum Zeitpunkt t = 0 von Glucose
auf Mannose gewechselt wurde. Berechnet nach Werten aus Figur 3.16.
85
KAPITEL3 .4
Regulation des Zuckerabbaus bei E. coli unter Kohlenstoff·
gesättigten Bedingungen
a. Einleitung
Glucose ist für E. coli ein bevorzugtes Substrat, was sich einerseits durch eine
hohe Wachstumsrate, andererseits durch den preferentiellen Abbau von
Glucose bei Anwesenheit verschiedener anderer Kohlenstoff-Quellen äussert.
Mischsubstratexperimente wurden erstmals von Monod (1942) systematisch
durchgeführt, indem er E. coli und andere Bakterien in Batchkulturen zwei
verschiedene Substrate gleichzeitig anbot. Je nach Substratzusammensetzung
war das Wachstum normal (monophasisch) oder diauxisch (biphasisch). In
Gegenwart von Lactose, Xylose, Arabinose, Galactose u.a. erzeugte Glucose
bei E. coli ein diauxisches Wachstum, während sowohl Fructose als auch
Mannose zusammen mit Glucose normales Wachstum ergab. Ein sehr älmliches Verhalten zeigte auch Salmonella typhimurium bei den getesteten
Zuckern.
Diauxie ist charakterisiert durch eine Lagphase, die nach dem vollständigen
Verbrauch der Glucose (oder eines anderen günstigen Substrats) eintritt. Eine
Lagphase wird beobachtet, wenn die für die Verwertung das andern Substrats
verantwortlichen katabolischen Enzymsysteme während der Glucoseabbauphase und unmittelbar danach nicht aktiv sind. Die Lagphase kann je nach
Substrat entweder deutlich ausgebildet sein oder nur angedeutet. So dauert
bei E. coli die Lagphase bei einem Substratgemisch von Glucose/Xylose oder
Glucose/Arabinose deutlich länger als bei solchen von Glucose/Galactose.
Die für die Diauxie verantwortlichen Regulationsmechanismen sind gut
untersucht und werden teilweise auch auf molekularer Ebene verstanden. Im
Schlussteil dieses Kapitels wird näher auf diese eingegangen. Diauxie kann
nur unter Kohlenstoff-gesättigten Bedingungen beobachtet werden. Standing
et al. (1972) konnten zeigen, dass Glucose und Xylose in einer E. coliBatchkultur diauxisch, in kontinuierlicher Kultur jedoch über einen grossen
Bereich der Verdünnungsrate simultan abgebaut wurden. Allgemein wird
beobachtet, dass auch das normale Wachstum meist durch den preferentiellen
Abbau von Glucose geprägt ist. Wächst eine E. coli-Kultur auf einem
Glucose/Fructose Gemisch, so wird vorerst der Grossteil der Glucose
86
abgebaut und erst danach die Fructose (Clark und Holms 1976); dazwischen
liegt eine Phase, die durch den simultanen Abbau der beiden Substrate
charakterisiert ist. Dieses Abbauverhalten wird sequentiell genannt. Auf
weitergehende Informationen über das Wachstumsverhalten von Bakterien
und Hefen auf Mischsubstraten sei auf die Reviews von Harder und Dijkhuizen (1982, 1976) verwiesen.
In letzter Zeit wurden grosse Anstrengungen unternommen, die innewohnenden Regulationsmechanismen auf molekularer Ebene zu verstehen, denn die
Bedeutung dieser Regulationsmechanismen scheint für Bakterien gross zu
sein. Gaudy (1962) und Stumm-Zollinger (1966) konnten zeigen, dass diese
Regulationsmechanismen nicht nur in Laborreinkulturen, sondern auch in
natürlich zusammengesetzten Mischkulturen zu beobachten sind. Allgemein
ist jedoch das Wachstumsverhalten natürlicher Populationen auf Misch-
substraten noch wenig erforscht.
Die meisten Informationen über Mischsubstratverwertung stammen aus
Batchversuchen, die meist in Reinkulturen und bei bei hohen Substratkonzentrationen (> 100 mg/l) durchgeführt wurden. Die Übertragung dieser
Resultate auf natürliche Wachstumsverhältnisse scheint jedoch fraglich, da
Mikroorganismen in ihrer natürlichen Umgebung nur ausnahmsweise auf so
hohe Substratkonzentrationen treffen. Aus diesem Grund wurde in diesem
Kapitel das Wachstwnsverhalten von E. coli in Mischsubstratmedien bei
niedrigen Substratkonzentrationen untersucht. Mittels der in Kapitel 2.4
beschriebenen Methode war es möglich, den Abbau der verschiedenen
Zuckern bis in den µg/l-Bereich zu verfolgen. Von speziellem Interesse war,
ob das bei hohen Substratkonzentrationen beobachtete Wachstumsverhalten
auch bei tiefen Substratkonzentrationen gültig ist.
b. Resultate
In diesem Kapitel wurde der Abbau von Glucose in Kombination mit einem
anderen Zucker (Arabinose, Galactose, Fructose) in Batchkultur untersucht.
Das Inokulum stammte, wenn nicht anders angegeben, jeweils aus einer
Glucose-limitierten Chemostatkultur.
Laut Literatur ist das Wachsturnverhalten von E. coli in einem Substratgemisch von Glucose und Galactose nicht eindeutig. Während Monod (1942)
eine deutlich reduzierte Wachstumsrate nach Verbrauch der Glucose fest-
87
) von einem seque ntiell en
stelle n ko1111te, beric htete n Stand ing et al. (1972
Diese Unter schie de wurd en
Verb rauch ohne sichtb are Lagp hase.
dlich er Stäm me verur sacht .
wahr schei nlich durch die Verw endun g unter schie
hohen Subst ratko nzent ration en
Der hier verw endet e Stam m zeigte bei
lten wie Mono d's Kultu r, indem
(> 100 mg/l) ein ähnli ches Wach stums verha
se einen deutl ich reduz ierten
aupha
die Wach stums rate nach der Gluco seabb
die mit Gluco se und Galac Wert annah m. In den folge nden Expe rimen ten,
ellen im Berei ch zwisc hen je 2
tose als einzi ge Kohl ensto ff- und Energ ie-Qu
h nie diaux ische s Wach stum
bis 12 mg/l durch gefüh rt wurd en, konn te jedoc
beoba chtet werde n.
auf einem Subst ratge misch von
Figur 3.19 zeigt das Wach stum von E. coli
tratko nzent ration von je ca.
D-Gl ucose und D-Ga lacto se bei einer Initia lsubs
5 mg/l.
,.......,
-........
*.00 1
100
6
Ol
E
'--'
Q)
<f)
0
-+-'
()
ro
ro
CJ
"O
0
5
80
4
60
0
()
40
2
20
1
:::l
CJ
0
E
c
tO
~
3
Q)
<f)
,.......,
0
l!)
'--'
0
0
0
480
60 120 180 240 300 360 420
Zeit [min]
mit Glucose ( [!]) und GalacFig. 3.19 Wachstum einer E. coli-Batchkultur
lnokulum stammt aus einer
tose (.A) als Kohlenstoff- und Energiequelle. Das
Chemostatkultur.
bei D = 0.2 h-1 gewachsenen, Glucose-limitierten
nm.
546
bei
r
Kultu
• bezeichnet die optische Dichte der
88
tumsphase
Man sieht, dass nach einer ca. 2-stündigen Lagphase eine Wachs
eine
folgte
Darauf
folgt, in welcher ausschliesslich Glucose abgebaut wurde.
.
wurden
tet
Phase, in deren Verlauf Glucose und Galactose simultan verwer
trat
rwertung
Der Übergang von Glucose- auf simultane Glucose-/Galactoseve
GlucosekonDiese
ein.
mg/l
2-3
ca.
bei einer Glucosekonzentration von
weniger
oder
mehr
ich
nsbere
zentration blieb im getesteten Konzentratio
grossen
h
hiedlic
konstant, auch wenn die Batchexperimente bei untersc
n
Figure
den
Initialsubstratkonzentrationen durchgeführt wurden. Dies ist in
Glucosekon3.20 und 3.21 dokumentiert, wo zusammen mit einer initialen
10 mg/l
oder
3.20)
(Figur
ose
Galact
mg/l
zentration von 5 mg/l entweder 2.5
begann
Fällen
beiden
In
war.
Galactose (Figur 3.21) im Medium vorhanden
n von
ntratio
ekonze
die simultane Verwertung durch E. coli bei einer Glucos
au
oseabb
ca. 2-4 mg/l. Diese Resultate deuten darauf hin, dass der Galact
wird und dass
durch eine Glucosekonzentration von > 2-4 mg/l verhindert
osekonzentraGalact
der
von
ngig
unabhä
n"
diese "Grenzglucosekonzentratio
tion ist.
:::::::::.
01
E
..__.
*.00 1
100
6
5
80
0
4
60
(')
3
Q)
Cf)
.......
ü
ro
ro
"O
0
40
2
20
Q)
Cf)
0
ü
.2
(')
1
0
0
60
....-.
E
c
<..O
""'"
LO
'---'
0
0
0
120 180 240 300 360 420
Zeit [min]
und GalacFig. 3.20 Wachstum einer E. coli-Batchkultur mit Glucose({!])
aus einer
stammt
m
Inokulu
Das
tose (t.) als Kohlenstoff- und Energiequelle.
ur.
statkult
bei D =0.2 h-1 gewachsenen, Glucose-limitierten Chemo
• bezeichnet die optische Dichte der Kultur bei 546 nm.
89
,......,
.........
O'I
E
*.001
12 -.-~~~~~~~~~~~~~~-r-200
11
10
9
0
.._.
8
(.)
CU
7
CU
6
CJ
5
'"O
0
4
Q)
3
cn
0
2
(.)
:J
1
CJ
0
'--'
150
Q)
cn
'Ec
100~
lD
'--'
0
50 0
0
60 120 180 240 300 360 420 480
Zeit [min]
Fig. 3.21 Wachstum einer E. coli-Batchkultur mit Glucose ([!])und Galactose (li.) als Kohlenstoff- und Energiequelle. Das lnokulum stammt aus einer
bei D = 0.2 h-1 gewachsenen, Glucose-linlitierten Chemostatkultur.
bezeichnet die optische Dichte der Kultur bei 546 nm.
*
Wurde der Batchversuch bei einer initialen Glucosekonzentration durchgeführt, welche unterhalb der Grenzglucosekonzentration lag, so wurde die
Galactose unmittelbar an eine kurze Induktionsphase von ca. 1 Stunde von
Beginn weg simultan mit !fer Glucose verwertet (Fig. 3.22).
Als Inokulum (ca. 0.12 mg/l TG BiOmasse) für die Experimente der Figuren
3.19 bis 3.22 dienten Zellen aus einer Glucose-limitierten Chemostatkultur,
welche über längere Zeit bei D = 0.2 h-1 gewachsen waren. Wurde als Inokulum schnell wachsende Zellen aus einer Glucose-limitierten
Chemostatkultur verwendet, so konnte bezüglich des Abbauverhaltens kein
Unterschied zu den bei D = 0.2 h-1 gewachsenen Inokulumzellen festgestellt
werden. Dies ist in Figur 3.23 dokumentiert, wo die Inokulumzellen über
längere Zeit kontinuierlich bei D = 0.76 h-1 gewachsen waren; auch hier
begann der Galactoseabbau bei einer Glucosekonzentration von ca. 2 mg/l.
90
*.0 01
50
~2.5
01
E
.___.
Q)
40
2
,.--,
(/)
......
0
u 1.5
30
CD
20
CO
CO
"O
0
Q)
(/)
0
u
1
10
.5
:::1
CD
0
0
60
E
c
<.D
"1"
lO
.__.
0
0
0
420
360
120 180 240 300
Zeit [min]
mit Glucose ( [!]) und GalacFig. 3.22 Wachstum einer E. coli-Batchkultur
Das Inokulum stammt aus einer
tose (6.) als Kohlenstoff- und Energiequelle.
n Chemostatkultur.
bei D = 0.2 h-1 gewachsenen, Glucose-limitierte
546 nm.
bei
r
Kultu
der
e
$ bezeichnet die optische Dicht
ctose-limitierten Chemostatkultur
Wurd e als Inokulum Zellen aus einer Gala
se verlängert. Dies ist in Figur
verwendet, so wurde die simultane Abbaupha
onzentration von je 12 mg/I der
3.24 ersichtlich, wo bei einer Initialsubstratk
ion zwischen 6 und 8 mg/I
Galactoseabbau bei einer Glucosekonzentrat
ionen hingegen begann der
begann. Bei kleinen Initialsubstratkonzentrat
(Fig. 3.25).
Galactose- zugleich mit dem Glucoseabbau.
91
*.001
200
12
..........
Ol 11
E
...._.
10
Q)
c.n
0
+-'
()
CIJ
CIJ
('.)
-0
0
Q)
c.n
0
()
::J
('.)
160
9
...--.
E
8
120 c
7
6
5
4
3
2
1
0
<..D
~
80
40
0
60
120 180 240 300 360 420
Zeit [min]
L!)
...._.
0
0
0
Fig. 3.23 Wachstum einer E. coli-Batchkultur mit Glucose ( [!]) und Galactose (A) als Kohlenstoff- und Energiequelle. Das lnokulum stammt aus einer
bei D = 0.76 h-1 gewachsenen, Glucose-limitierten Chemostatkultur.
bezeichnet die optische Dichte der Kultur bei 546 nm.
*
92
*.00 1
200
......., 14
::::::::
Ol 13
E 12
'--'
11
Q)
Cf)
10
0
.......
0
CU
CU
C)
"'O
0
Q)
Cf)
0
0
::J
C)
160
...-.
E
120 c
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
lO
-.::!'"
l.()
80 .........
0
40
0
0
0
480
420
360
60 120 180 240 300
Zeit [min]
mit Glucose ( l!l) und GalacFig. 3.24 Wachstum einer E. coli-Batchkultur
Inokulum stammt aus einer
tose ( A) als Kohlenstoff- und Energiequelle. Das
Chemostatkultur.
bei D = 0.8 h-1 gewachsenen, Galactose-limitierten
nm.
546
• bezeichnet die optische Dichte der Kultur bei
93
.--.
.........
*.00 1
50
3
Ol
.52. 5
40
Q)
(f)
0
ü
~
ro
.--.
2
(9
1. 5
-0
0
1
30
0
ü
.5
CJ
0
c
tO
..q-
20
10
Q)
(f)
E
LO
..__,
0
0
:::l
0
60
120 180
Zeit [min]
240
300
360
( l!J) und GalacFig. 3.25 Wachstum einer E. coli-Batchkultur mit Glucose
aus einer
stammt
m
lnokulu
Das
quelle.
Energie
und
tose ( A,) als Kohlenstoffur.
statkult
Chemo
tierten
se-limi
bei D = 0.2 h-1 gewachsenen, Galacto
• bezeichnet die optische Dichte der Kultur bei 546 nm.
94
D-Glucose und D-Fructose werden bei E. coli beide durch Phosphotransferase-Systeme transportiert. Eine Mischung dieser Zucker unter Kohlenstoffgesättigten Bedingungen führt zum sequentiellen Abbau, wobei zuerst die
Glucose und dann die Fructose verwertet wird. Dies ist in Figur 3.26
dokumentiert. Auch hier kann man eine Phase simultanen Abbaus von
Glucose und Fructose erkennen, welche bei einer Glucosekonzentration von
ca. 6 mg/l einsetzt. Wurden die Initialsubstratkonzentrationen auf je 4.5 mg/l
erniedrigt, so begann der simultane Abbau von Frnctose und Glucose bei
einer Glucosekonzentration von ca. 3 mg/l (Fig. 3.27). Im Gegensatz zum
Galactoseabbau begann der Fructoseabbau in Gegenwart von Glucose bei
allen Initialglucosekonzentrationen erst nach einer längeren Wachstumsphase
auf Glucose. Dies ist in Figur 3.28 ersichtlich, wo selbst kleinste Glucosekonzentrationen eine Frnctoseverwertung für längere Zeit verhinderten. Das
Inokulum aller mit Glucose und Fructose durchgeführten Experimente
stammte aus einer Glucose-limitierten Chemostatkultur.
*.001
200
12
.:::::::::
11
Ol
E 10
'--'
,......,
Q)
(/)
0
.......
(_)
:J
._
u_
"O
0
Q)
(/)
0
(_)
:::::l
CJ
150 ,......,
E
9
8
c
7
6
5
4
3
2
1
0
100*
l.()
'--'
0
50 0
0
60
0
420
120 180 240 300 360
Zeit [min]
Fig. 3.26 Wachstum einer E. coli-Batchkultur mit Glucose ( [!]) und Fructose (A) als Kohlenstoff- und Energiequelle. Das lnokulum stammt aus einer
bei D = 0.4 h-1 gewachsenen, Glucose-limitierten Chemostatkultur.
bezeichnet die optische Dichte der Kultur bei 546 nm.
*
95
..........
Ol
E
.........
5
*.001
100
4
80
3
.--.
E
60 c
2
'<;f"
LO
.........
Q)
U)
0
.......
u
::J
'-
lL
"D
0
Q)
U)
0
lO
40
1
20
0
0
0
::J
0
0
0
0
120
180
240
300
360
420
480
60
Zeit [min]
Fig. 3.27 Wachstum einer E. co/i-Batchkultur mit Glucose ( (!)) und Fructose ( A) als Kohlenstoff- und Energiequelle. Das Inokulum stammt aus einer
bei D = 0.2 h-1 gewachsenen, Glucose-limitierten Chemostatkultur.
• bezeichnet die optische Dichte der Kultur bei 546 nm.
96
*.00 1
25
.-..1. 2
:::::::
Ol
E
..__.
1
Q)
<FI
0
......
u
:J
......
••
.8
LL
.6
-0
0
.4
0
u
E
c
<.O
~
10
5
.2
:J
('.)
,..-,
15
Q)
<FI
20
0
0
U')
..__.
0
0
0
480
420
360
60 120 180 240 300
Zeit [min]
( [!]) und FrucFig. 3.28 Wachstum einer E. coli-Batchkultur mit Glucose
aus einer
stammt
m
Inokulu
Das
quelle.
tose ( t. ) als Kohlenstoff- und Energie
ur.
statkult
Chemo
erten
bei D =0.2 h-1 gewachsenen, Glucose-limiti
• bezeichnet die optische Dichte der Kultur bei 546 nm.
97
vorerst die
e und Arabinose vor, so wurde
Liegt in einer Batchkultur Glucos
ca. 20
von
se
Darauf folgte eine Lagpha
Glucose vollständig verwertet.
Lagder
d
abbau begonnen wurde. Währen
Minuten, ehe mit dem Arabinose
synyme
bau/-transport involvierten Enz
phase wurden die im Arabinoseab
Konzentradass Diauxie auch im kleinen
thetisiert. Dieses Beispiel zeigt,
tionsbereich stattfinden kann.
*.0 01
50
:::_'2. 5
Ol
E
.__,
())
•
2
(/)
0
c:
i)
CO
'-
<{
"O
0
())
(/)
0
30
1. 5
20
1
•
.5
(.)
:::i
CJ
0
40
0
60
10
,.......,
E
c
~
""1"
l[)
.__,
0
0
0
0
120 180 24 0 30 0 36 0 42
Zeit [min)
(!]) und Aracoli-Batchkultur mit Glucose (
Fig. 3.29 Wachstum einer E.
mt aus einer
Energiequelle. Das lnokulum stam
binose (.6) als Kohlenstoff- und
r.
cose-limitierten Chemostatkultu
bei D = 0.2 h-1 gewachsenen, Glu
Kultur bei 546 nm.
bezeichnet die optische Dichte der
*
98
c. Diskussion
Substrate zu
Glucose hat die Fähigkeit, katabolische .Enzyme anderer
"Glucoseen
reprimieren. Epps und Gale (1942) nannten dieses Phänom
olit-RepresEffekt". Magasanik (1961) ersetzte diesen Begriff durch "Katab
der Synthese
sion". Katabolit-Repression bedeutet die permanente Inhibition
(oder einem
e
Glucos
von
wart
Gegen
anderer katabolischer Enzyme in
einen
durch
ion
Inhibit
anderen günstigen Substrat), wobei die
.
kommt
e
zustand
ts
(hypothetischen) Kataboliten des reprimierenden Substra
allwird
e
Die Synthese der für die im Kohlehydratabbau zuständigen Enzym
der Induktor
gemein durch zwei cytoplasmatische Moleküle reguliert:
nicht direkt
können
üle
Molek
Diese
(Effektor) und zyklisches AMP (cAMP).
Regulatorein
über
daher
mit der DNA in Wechselwirkung treten und wirken
(cAMP
CRP
man
protein. Das cAMP-spezifische Regulatorprotein nennt
CRP
und
Receptor Protein) oder CAP (Catabolite Activator Protein). cAMP
betreffenden
bilden einen Komplex, welcher mit den Promotoren der
RNA-Polyder
g
Bindw1
die
wird
h
katabolischen Operons reagiert. Dadurc
n erstmals
konnte
(1968)
Pastan
merase an die DNA ermöglicht. Perhnan und
se in
ctosida
ß-Gala
der
zeigen, dass die Zugabe von cAMP die Synthese
zu
se
teilwei
E. coli stimuliert und die durch Glucose ausgeübte Repression
bei
cAMP
überwinden vermag. Da die intrazelluläre Konzentration von
1965),
land
Suther
und
an
(Maktn
ist
Zellen, die auf Glucose wachsen, klein
den
auf
ression
lit-Rep
Katabo
schlossen sie, dass die durch Glucose ausgeübte
niedrigen cAMP-Level zurückzuführen ist.
durch zwei
Die intrazelluläre cAMP-Konzentration wird im Wesentlichen
aus ATP
gegenläufige Prozesse bestimmt (i) durch die Synthese von cAMP
in das
cAMP
von
Efflux
den
durch die Adenylatcyclase und (ii) durch
em.
ortsyst
Transp
Medium durch ein chemiosmotisch betriebenes
tion des
Die ausserordentliche Bedeutung des cAMP-Moleküls für die Regula
se und
Synthe
Kohlehydratabbaus lässt vermuten, dass die beiden Prozesse,
llsystem
Ausscheidung von cAMP, von einem übergeordneten Kontro
dass
hten,
beobac
n
konnte
(1979)
reguliert werden. Peterkofsky und Gazdar
ntials
enpote
Proton
des
tion
die Aktivität der Adenylatcyclase durch Dissipa
vermuten
mittels spezifischer Ionophoren in vivo inhibiert wurde. Sie
latcyclase
deshalb, dass das Protonenpotential die Aktivität der Adeny
latcyclasebestimmt. Eine wichtige Funktion in der Kontrolle der Adeny
PTSeines
enheit
Abwes
In
haben.
zu
Aktivität scheint auch das PT-System
sich
d
währen
Form,
ter
Zuckers ist der Grossteil des EIIIGlc in phosphorylier
99
in dessen Gegenwart der Anteil der dephosphorylierten Form erhöht. Da der
intrazelluläre cAMP-Level in Anwesenheit eines PTS-Zuckers im Medium
sowie bei Mutanten mit fehlendem EfilGlc stets gering ist, wurde
geschlossen, dass das phosphorylierte EfilGlc die Adenylatcyclase aktiviert.
Eine andere Möglichkeit wäre, dass die Aktivität der Adenylatcyclase über
die zellinterne ATP-Konzentration reguliert wird.
Desai und Saier (zitiert in Saier 1985) beobachteten, dass auch intrazellulär
akkumulierte Zuckerphosphate eine starke Inhibition auf die Aktivität der
Adenylatcyclase ausüben. Die Art dieser Inhibition ist jedoch noch völlig
unbekannt.
Der Efflux von cAMP wird durch das CRP-Protein beeinflusst (Nelson et al.
1982), wobei wahrscheinlich der cAMP-CRP Komplex als negativer Effektor
wirkt (Saier 1985).
Obwohl die Bedeutung des cAMP-CRP Komplexes auf die Expression verschiedener Operons unbestritten ist, ist dessen alleinige Rolle im Prozess der
Katabolit-Repression zweifelhaft (Ullmann 1974, 1985). Verschiedene
Beobachtungen weisen darauf hin, dass wahrscheinlich noch zusätzliche,
unbekannte Regulationsmechanismen involviert sind. So konnten GuidiRotoni et al. (1980, 1982) bei einer E. coli Mutante repressive Phänomene in
Abwesenheit von sowohl cAMP als auch seinem Rezeptorprotein
beobachten.
Glucose kontrolliert aber den Abbau anderer Substrate nicht nur über die
Repression, sondern vermag auch schon induzie1te Enzymsysteme zu inhibieren. Diese Inhibition, die Mc Ginnis und Paigen (1969) "Katabolit-Inhibition"
nannten, verhindert die Aufnahme einer ganzen Anzahl verschiedener Kohlehydrate, wie Fructose, Arabinose, Galactose, Lactose. Nicht nur Glucose,
sondern auch deren Analoge a-Methylglucosid, 1- oder 2-Deoxyglucose inhibieren die Aufnahme anderer Substrate, allerdings erst, wenn die Zellen
vorher für die Aufnahme solcher Analoge induziert waren. Daraus folgt, dass
die blosse Gegenwart solcher Analoge im Medium nicht genügt, sondern dass
die Inhibition erst durch deren Aufnahme zustande kommt. Dies ist in
Übereinstimmung mit den Resultaten von Asensio et al. (1963), welche bei
Mutanten mit defektem Glucose-PTS keine Inhibition der Galactoseaufnahme durch Glucose feststellen konnten.
Die Aktivität induzierbarer Enzyme ist abhängig von der Induktorkonzentration. In vielen Fällen ist nicht die extra-, sondern die intrazelluläre Induktorkonzentration ausschlaggebend für den Induktionsgrad der katabolischen
Enzymsysteme, wie z.B. bei den Galactose-spezifischen katabolischen
100
Enzymen. In Fällen, wo die Aufnahme eines Induktors durch Transportinhibition verhindert wird, sodass keine Induktion der katabolischen Systeme
zustandekommt, spricht man deshalb von "Inducer Exclusion" (Cohn und
Horibata 1959 a-c).
Es wurden mehrere Hypothesen vorgeschlagen, die für den Prozess der
lnducer Exclusion in Frage kommen.
(i) Membranpotential. Es ist schon länger bekannt, dass das Protonenpotential
die Aktivität einiger Aufnahmesysteme beeinflusst. Es wird vennutet, dass
dabei die Eigenschaften der Carrier Proteine verändert werden.
(ii) Kompetitive Inhibition. Dies wird beobachtet, wenn zwei Substrate um
dasselbe Transportsystem kompetieren. Ein gut belegtes Beispiel dafür ist die
Kornpetition der Mannose mit der Glucose um die EIIMan_Pennease. Da
Mannose in E. coli nur über das Mannose-PTS transportiert werden kann, für
Glucose jedoch noch weitere Transportsysteme existieren, führt diese
Kornpetition zu sequentiellem Abbau der beiden Zucker, wobei zuerst
Glucose und erst danach die Mannose verwertet wird.
(iii) Inhibition durch intrazelluläre Zuckerphosphate. Intrazellulär
akkumulierte Zuckerphosphate inhibieren die Aufnahmesysteme einer ganzen
Reihe verschiedener Substrate. Dies konnte sowohl in ganzen Zellen, als auch
im Rohextrakt sowie in gereinigten Permeasepräparaten beobachtet werden.
Die Experimente von Komberg (1973) zeigten, dass intrazelluläre Hexosephosphate das Fructose-PTS stärker inhibierten als das Glucose-PTS. Der
Mechanismus dieser Inhibition ist noch unbekannt.
(iv) Kompetition verschiedener PT-Systeme um die Phosphorylgruppe des
HPr oder einer andern gemeinsamen Komponente des PTS (Scholte und
Postma 1981, Dills et al. 1980). Die grössere Affinität eines bestimmten
Eli/EH-Systemes zum phosphorylierten HPr kann zu preferentieller
Phosphorylierw1g der betreffenden Eil-Permease führen.
(v) Inhibition von Nicht-PTS-Aufnahmesystemen durch Interaktionen mit
EillGlc des PTS. Osumi und Saier (1982) konnten erstmals zeigen, dass das
EffiGlc sich in Anwesenheit eines Substrats des Lactose-Transportsystems
direkt mit dem Lactose-Carrier bindet. Phosphoryliertes EIIIGlc bindet sich
jedoch nicht mit dem Lactose-Carrier. Dieser Mechanismus ist wahrscheinlich auch für die Transportinhibition von Glycerin, Maltose und Melibiose
verantwortlich.
Die Resultate der Batchversuche zeigten, dass Galactose auch in Gegenwart
von Glucose abgebaut wurde. Bei Galactose-gewachsenem Inokulwn begann
101
sekonzentration von
der simultane Glucose-/Galactoseabbau bei einer Gluco
einer Glucosekonbei
lum
lnoku
em
ca. 6-8 mg/l, bei Glucose-gewachsen
Lengeler (1966)
sowie
zentration von ca. 2-4 mg/l. Adhya und Echols (1966)
Transport von
den
konnten zeigen, dass hohe Glucosekonzentrationen
die Induktion der
Galactose inhibieren. Diese Transportinhibition verhindert
tor, d.h. Galactose,
Galactose-spezifischen Abbauenzyme, indem der Induk
Übereinstimmung
in
ist
Dies
ion).
nicht in die Zelle gelangt (lnducer Exclus
ewachsenem
tose-g
Galac
mit
e
mit den Resultaten der Batchversuche, welch
n weg vorBegin
Zellen inokuliert wurden. Obwohl hier die Gai-Enzyme von
6-8 mg/l
ca.
von
handen waren, wurde oberhalb einer Glucosekonzentration
keine oder nur wenig Galactose abgebaut.
von GlucoseIm vorigen Kapitel konnte gezeigt werden, dass die Zellen
rtsystem
ranspo
tose-T
Galac
tes
limitierten Chemostatkulturen ein voll-induzier
syntose
Galac
von
e
Zugab
besitzen, dass jedoch die Gai-Enzyme erst nach
Batch
den
in
lb
thetisiert wurden. Dadurch lässt sich erklären, wesha
Galacn,
iert wurde
versuchen, die mit Galactose-gewachsenen Zellen inokul
aut wurde als in
abgeb
onen
entrati
sekonz
Gluco
tose bei deutlich höheren
wurden. Die Galacjenen, die mit Glucose-gewachsenen Zellen inokuliert
gewisse Menge
eine
h
tose-gewachsenen lnokulumzellen enthalten nämlic
Galactose
sofort
,
Gai-Enzyme, die, nach Aufhebung der Transportinhibition
se-gewachsenen
abzubauen begannen. Unter Verwendung eines Gluco
tionsphase, in deren
Inokulums jedoch konnte Galactose erst nach einer Induk
n. Daraus kann
werde
aut
abgeb
n,
Verlauf die Gai-Enzyme synthetisiert wurde
extrazellulären
einer
bei
geschlossen werden, dass die Transportinhibition
weiteren
einem
In
.
Glucosekonzentration von ca. 6-8 mg/l aufgehoben wurde
lumInoku
te der
Versuch konnte festgestellt werden, dass die Wachstumsra
zellen keinen Einfluss auf das Abbauverhalten hatte.
atkonzentrationen
Die Beobachtung, dass eine Variation der Initialsubstr
deutet daraufhin,
hatte,
ten
so,Glc:s0 ,GaJ keinen Einfluss auf das Abbauverhal
bestimmt wurde.
dass die Inhibition einzig durch die Glucosekonzentration
tion der GalactoseDiese Beobachtung spricht gegen eine kompetitive Inhibi
ngs nur, wenn die
aufnahme durch die Glucose. Diese Aussage gilt allerdi
Galactose in der
Affinitäten des Galactosetransportsystems für Glucose und
erte grosse
Km-W
n
duelle
indivi
gleichen Grössenordnung liegen. Sollten die
s
von
h
0 ,01c:so,Gal
Unterschiede aufweisen, dann müsste ein grösserer Bereic
Einfluss extrazelgeprüft werden. Zur Zeit existiert kein Modell, welches den
ats beschreibt. Da
lulärer Glucose auf den Transport eines anderen Substr
n, scheint es
besitze
se
Gluco
zu
tät
beide Galactosepermeasen ebenfalls Affini
102
möglich, dass sich Glucosemoleküle in Gegenwart hoher Glucosekonzentrationen an die Galactosepermeasen binden und auf diese Weise die Galactoseaufnahme blockierten.
Die Batchversuche mit Glucose und Fructose zeigten, dass Fructose in der
letzten Phase des Glucoseabbaus simultan mit der Glucose verwertet wurde.
Bei einer Anfangskonzentration von je 10 mg/I begann die Fructoseaufnahme
bei einer Glucosekonzentration von ca. 6 mg/l. Dies deutet darauf hin, dass
sowohl die durch Glucose ausgeübte Repression als auch Inhibition der
Fructoseaufnahme noch während des Wachstwns auf Glucose aufgehoben
wurde. Im Gegensatz zur Galactoseverwertung in Gegenwart von Glucose
wurde die Fructose auch bei kleinen Anfangskonzentrationen (1-2 mg/I) erst
nach einer längeren Lagphase abgebaut. Daraus kann geschlossen werden,
dass die Transportinhibition bei der Fructose durch Glucose durch einen
anderen Mechanismus kontrolliert wird als bei der Galactose. Fructose wird
in kleinen Konzentrationen ausschliesslich über das Fructose-PTS transportiert. Es scheint daher möglich, dass die Kornpetition um das phosphorylierte HPr (oder EI) zwischen dem Fructose- und Glucose-PTS zur beobachteten Inhibition des Fructoseabbaus zu Beginn des Batches führte.
Arabinose wurde in Gegenwart höherer Konzentrationen von Glucose erst
nach dem vollständigen Abbau der Glucose und einer Lagphase von ca. 20
Minuten abgebaut. Dieses Beispiel zeigt, dass Diauxie auch im tiefen
Konzentrationsbereich beobachtet werden kann. Im Gegensatz dazu wuchs
die E. coli-Kultur auf einem Substratgemisch von Glucose und Galactose nur
bei hohen lnitialsubstratkonzentrationen diauxisch, bei tiefen hingegen
normal. Dieser Unterschied könnte dadurch verursacht worden sein, dass die
Arabinose-spezifischen Abbauenzyme stärker reprimiert wurden als diejenigen der Galactose, indem sie erst bei höheren cAMP-Konzentrationen
induziert wurden und/oder dass die Transportinhibition erst bei geringsten
Glucosekonzentrationen aufgehoben wird.
Es ist bekannt, dass die Tendenz für die simultane Verwertw1g zweier
Substrate in Chemostatkulturen bei niedrigen Verdünnungsraten grösser ist
als bei hohen. Dies ist bei E. coli in einem Substratgemisch von Glucose und
Fructose der Fall. Bei niedrigen Verdünnungsraten wurde hier Glucose und
Fructose simultan verwertet, bei hohen (D > 0.6 h-1) hingegen überwog der
Glucoseabbau und extrazelluläre Fructose akkumulierte im Medium (Mateles
et al. 1967). Für Harder und Dijkhuizen (1976) ist diauxisches Wachstum in
Batchkultur und präferentieller Abbau eines Substrates bei hohen
103
für dasselbe
Wachstumsraten im Chemostat verschiedene Ausdrucksformen
Verdünder
s
Einflus
Phänomen. Es ist jedoch nicht klar, ob der direkte
ntration
ekonze
nungsrate oder die von der Verdünnungsrate abhängige Glucos
Methode der
für dieses Verhalten verantwortlich ist. Die hier entwickelte
Standing
Restsubstratbestimmung ist sehr geeignet, um diese Frage zu klären.
ten E. coliet al. (1972) konnten bei einer Glucose/Galactose-limitier
Bereich der
ganzen
den
über
Chemostatkultur beobachten, dass Galactose
tet wurde.
verwer
n
Verdünnungsrate bis gegen den Auswaschpunkt simulta
wurde
Kultur
Gemischte Glucose/Galactoseverwertung in kontinuierlicher
Standing et al.
auch in dieser Arbeit untersucht und die Beobachtungen von
die Wachs(1972) konnten bestätigt werden. Dies deutet darauf hin, dass
Abbaudas
auf
s
Einflus
tumsrate bei dieser Substratkombination keinen
sowohl
n
ergabe
h-1
verhalten hat. Messungen der Restsubstrate bei D = 0.86
lagen.
mg/l
1
für Glucose als auch für Galactose Konzentrationen, die unter
ekonzentraDa gemäss den Resultaten der obigen Batchversuche die Glucos
Inhibition
die
für
die
liegt,
n
ntratio
Konze
tion damit deutlich unterhalb der
bei hohen
ertung
anverw
Simult
die
ist
der Galactoseverwertung notwendig ist,
Verdünnungsraten leicht erklärbar.
104
4. ABSCHLIESSENDE DISKUSSION
entration unter
Die Abhängigkeit der Wachstumsrate von der Substratkonz
ung in der
Bezieh
ten
entals
steady state Bedingungen ist eine der fundam
Monoddas
durch
Mikrobiologie. Diese Beziehung wird üblicherweise
e
nur wenig Daten
Modell beschrieben. Eine Literaturrecherche ergab, dass
Wachstumskinetik
existieren, die zur Entwicklung oder Verifizierung einer
Daten, wie auch
n
meiste
Die
tigen.
unter steady state Bedingungen berech
n, stammen
führte
ells
d-Mod
jene von Monod, die zur Formulierung des Mono
n eingunge
Bedin
aus Batchkulturen, wo sich in keiner Phase steady state
ein
sich
lässt
en
stellen. In der kontinuierlichen Verlahrensweise hingeg
der
Ermittlung
definierter Zustand über längere Zeit erhalten. Die
messung des
Direkt
die
ert
erlord
ulturen
Wachstumskinetik aus Chemostatk
in kleinsten
nur
ate
Substr
ge
limitierenden Substrats, welches für günsti
ulturen
ostatk
Chem
aus
Konzentrationen vorliegt. Der Mangel an Daten
Bestim
e
genau
widerspiegelt die analytischen Schwierigkeiten, welche die
vorgestellte HPLC
mung des Restsubstrats mit sich bringt. Die in Kapitel 2.4
sich für diese
erwies
e
hydrat
Kohle
r
erende
Methode zur Bestimmung reduzi
wurden die
de
Metho
dieser
s
Fragestellung als sehr geeignet. Mittel
ultur von
ostatk
Chem
n
Restglucosekonzentrationen einer Glucose-limitierte
zeigten,
ate
Result
E. coli bei verschiedenen Verdünnungsraten gemessen. Die
onzentration nur
dass die Beziehung der Wachstumsrate zur Restglucosek
konnte, weil die
ungenau durch das Monod-Modell beschrieben werden
entrationen
atkonz
Substr
eren
niedrig
hohen Wachstumsraten bei signifikant
at ist in
Result
Dieses
t.
erreicht wurden als vom Monod-Modell prognostizier
von
jenen
mit
z.B.
Übereinstimmung mit neueren Daten aus der Literatur,
se
und Gluco als
Shehata und Marr (1971) oder Ishida et al. (1982) mit E. coli
d-Modells scheint
limitierendes Substrat. Dieser Schwachpunkt des Mono
im Jahre 1967
schon ziemlich früh erkannt worden zu sein, denn schon
imp„ession,
feit
widely
a
also
berichtete Powell (1967): "But there exists
aches its
appro
µ
le
frequently spoken but not written about, that the variab
mental data „.".
asymptote too slowly tobe a good rep1'esentation of experi
gigkeit von der
Die Kenntnis der Beziehung der Wachstumsrate in Abhän
nismen des
mecha
ations
Substratkonzentration eröffnet die Möglichkeit, Regul
wurde oft
So
W achsturnsprozesses auf kinetischem Wege zu ergründen.
Michaelis-Menten
argumentiert, dass die Monod-Kinetik - formal gleich der
105
Gleichung für die Enzymkinetik - dadurch zustandekommt, dass ein einziges
Enzym, welches die 'master reaction' katalysiert, die Wachstumsrate über
den ganzen Substratkonzentrationsbereich bestimmt. Theoretisch kann gesagt
werden, dass die Gesamtrate eines Systems, bestehend aus mehreren sich
folgenden, reversiblen Enzymreaktionen, von der Rate und Gleichgewichtskonzentration jeder einzelnen Enzyrnreaktion abhängig ist. Eine 'master
reaction' kann deshalb nur dann die Gesamtrate kontrollieren, wenn ihre Rate
bei allen Substratkonzentrationen sehr viel kleiner ist als die aller übrigen.
Monod (1949) meinte dazu: " Where hundreds, perhaps thousands of
reactions linked in a network rather than as a chain are concerned, as it is
the growth ofbacterial cells, such a situation is ve1y improbable ... ".
Um die Monod-Kinetik zu erfüllen, muss vorausgesetzt werden, dass sowohl
die Konzentration des ratenbestimmenden Enzyms (ausgedrückt als Anzahl
Enzyme pro Einheit TG Biomasse) als auch die Affinität dieses Enzyms zum
Substrat unabhängig von der Wachstumsrate einen konstanten Wert besitzt.
Das von der Monod-Kinetik abweichende Verhalten der im Chemostat
ermittelten Wachstumskinetik könnte deshalb bedeuten, dass die
Enzymkonzentration und/oder Affinität des ratenlimitierenden Enzyms bei
höheren Wachstumsraten zugenommen hat, weshalb das 'master reaction'Konzept nicht a priori abgelehnt werden kann.
Eine aus der Nicht-Gleichgewichts-Thermodynamik stammende Theorie von
Westerhoff et al. (1982) erwies sich als sehr geeignet, um die in dieser Arbeit
gefundene Beziehung der Wachstumsrate zur steady state Glucosekonzentration zu beschreiben. Gemäss dieser Theorie ist der Substrat-/Metabolitenflux
abhängig von der Gibb'schen Freien Energie zwischen dem Substrat und den
Produkten des Wachstums; mit zunehmender extrazellulären Substratkonzentration wächst auch die Gibb'sche Freie Energie, was zu einer
Zunahme der spezifischen Wachstumsrate führt. Ungleich den anderen
Modellen wird mit diesem Modell der Wachstumsprozess nicht mehr auf der
Ebene enzymatischer Reaktionen analysiert. Eine solche Analyse ist nämlich
ausserordentlich schwierig durchzuführen, da bekanntlich die Zusammensetzung der Zelle und damit auch der Enzyme je nach Wachstumsbedingungen stark variieren kann. So nimmt z.B. der prozentuale Anteil der
RNA mit zunehmender Wachstumsrate stark zu, der der DNA ab (Herbert
1961). Solche Änderungen der Zellzusammensetzung können nicht isoliert
betrachtet werden, denn eine erhöhte zelluläre RNA-Konzentration bedingt,
dass die Aktivitäten der an der RNA-Synthese beteiligten Enzyme ebenfalls
zunehmen müssen. Das Prinzip der totalen Integration (Dean und Hinshel-
106
wood 1966) beschreibt autosynthetisches Wachstum aufgrund gegenseitig
voneinander abhängiger Wechselwirkungen, wobei die Synthese von
Enzymen und anderen Zellkomponenten in ein netzförmig strukturiertes
Reaktionsgefüge integriert ist, welches aus in sich geschlossenen Kreisläufen,
den Maschen des Netzwerks, besteht. Eine solche gegenseitig abhängige
Wechselwirkung lässt sich beispielsweise anhand der rRNA- und Proteinsynthese illustrieren: Die Proteinsynthese ist abhängig von der rRNA und die
rRNA-Synthese ihrerseits ist abhängig von gewissen Proteinen. Anhand
einfacher mathematischer Gleichungen konnten Dean und Hinshelwood
(1966) zeigen, dass die Proportionen d_er einzelnen Zellkomponenten
während des exponentiellen Wachstums von den Wachstumsbedingungen
abhängig sind und einen im Rahmen des Genotyps definierten Zustand
annehmen. Obwohl das Modell die tatsächlichen Verhältnisse des
Wachstumsprozesses stark vereinfacht darstellt, lassen sich damit
verschiedene Phänomene wie Adaption der Zelle an neue Wachstumsbedingungen, Einfluss von Inhibitoren, Induktion und Repression erklären.
Die Konsequenzen des Prinzips der totalen Integration führen zum NetzwerkTheorem (Dean und Hinshelwood 1966). Danach nehmen in einer konstanten
Umgebung die Proportionen der einzelnen Zellkomponenten konstante Werte
an, welche der Zelle erlaubt, sich bei den gegebenen Verhältnissen mit einer
maximalen Wachstumsrate zu vermehren. Jede Abweichung von diesem
idealen Zustand führt zu ratenlimitierenden Schritten. Werden Zellen, die
längere Zeit unter konstanten Bedingungen gewachsen sind, in ein neues
Medium gebracht, so ändert die Zellzusammensetzung derart, dass sich
wiederum optimales Wachstum einstellt; das System ist also selbstregulierend.
Das Netzwerk-Theorem erklärt auch, warum Wachstumskinetiken, die aus
Batchkulturen ermittelt wurden, nicht vergleichbar sind mit solchen aus
Chemostatkulturen. In einer Batchkultur sind die Wachstumsbedingungen
einzig während der exponentiellen Phase über längere Zeit mehr oder
weniger konstant, wo sich die Zellen mit der maximalen Wachstwnsrate vermehren. Während dieser Phase besitzt die Zelle eine Struktur, die diesen
Verhältnissen angepasst ist. Mit dem Eintreten in die Substrat-limitierte
Phase ändern die Wachstumsbedingungen für die Zellen drastisch, indem der
Substrat-/Metabolitenflux abnimmt und in kurzer Zeit auf null fällt. Da
während der Substrat-limitierten Phase zu keinem Zeitpunkt konstante
107
Wachstumsbedingungen herrschen, vermag die Zelle bei den betreffenden
Substratkonzentrationen keine optimale Zellstruktur aufzubauen.
In der Literatur wird bakterielles Wachstum im Chemostat häufig mit steady
state Wachstum gleichgesetzt. Periodische Messungen der Restglucosekonzentrationen im Chemostat zeigten, dass wohl längere Phasen mit relativ
konstanten Glucosekonzentrationen existierten, dass diese aber von Zeit zu
Zeit durch kürzere Phasen unterbrochen wurden, die aufgrund grosser
Konzentrationsschwankungen nicht mit einem steady state vereinbart werden
konnten. Solche Phasen, die als Störungen bezeichnet wurden, waren durch
erhöhte Glucose- und Fructosewerte charakterisiert. Gemäss dem NetzwerkTheorem treten solche Störungen dann auf, wem1 die Proportionen der Zellkomponenten vom idealen Zustand abweichen. Dadurch entsteht ein
Flaschenhals, wobei in der Folge Metaboliten akkumuliert werden. Die im
Medium auftretende Fructose gab zur Vermutung Anlass, dass sich während
den Störungen intrazellulär Fructose-6-Phosphat und möglicherweise auch
Glucose-6-Phosphat akkumulierten, die, nach Induktion eines zellulären
Mechanismus' zwecks Herstellung der steady state Metabolitenkonzentrationen, als Fructose und Glucose ins Medium verschoben wurden. Da die
Hexosephosphate die Funktion von Regulatoren im Stofftransport einnehmen, scheint die Annahme eines solchen Mechanismus, vergleichbar
einem Ventil, eine plausible Erklärung zu sein.
Die Chromatograrnme von Proben Glucose-limitierter E. co/i-Chemostatkulturen hatten bezüglich des Monosaccharid-Spektrums ein ähnliches
Aussehen wie diejenigen natürlicher Gewässerproben. Desgleichen bildeten
Glucose und Fructose in den Messungen von Mopper et al. (1980) den
Hauptbestandteil der Zucker in Meerwasserproben. Während in den natürlichen Gewässerproben das Auftreten der Glucose mit der Hydrolyse
glucosehaltiger Zellbestandteile von abgestorbenen und lysiertem Plankton
erklärt werden kann, ist der Grund für das Fructosevorkommen weniger klar.
So konnten Handa und Yanagi (1969) sowie Liebezeit (zitiert in Mopper et
al. 1980) in Heisswasserextrakten des Plaktons Glucose und in geringeren
Konzentrationen auch andere Monosaccharide nachweisen, nie jedoch
Fructose. Mopper et al. (1980) konnten zeigen, dass der rein chemische
Isomerisationsprozess von Glucose zu Fructose (s. Kap. 2.4, Abschnitt 6)
keine ausreichende Erklärung für die in natürlichen Gewässern vorkommenden Fructosemengen sein kann. Sie bestimmten in einer schwach
alkalischen Lösung ein Gleichgewichtsverhältnis Fructose: Glucose von 0.3 -
108
0.4, während in den Meerwasserproben eines von 0.8 - 1.4 gefunden wurde.
Deshalb vermuten die Autoren, dass die lsomerisationsrate von Glucose zu
Fructose im Meerwasser durch Exoenzyme und/oder Photokatalyse
beschleunigt wird. Vergleicht man diese Ergebnisse mit denjenigen einer
Glucose-limitierten Chemostatkultur von E. coli, so liegt eine weitere
Hypothese auf der Hand, nämlich dass die in natürlichen Gewässern
vorkommende Fructose ein Zwischenprodukt des bakteriellen Zuckerabbaus
sein könnte.
Die Wachstumsbedingungen für Mikroorganismen in einem Chemostat sind
nur bedingt vergleichbar mit solchen von natürlichen aquatischen Systemen.
Dies betrifft in erster Linie die steady state Verhältnisse, welche so ausgeprägt in natürlichen Lebensräumen nicht vorhanden sind. Das Auftreten
von Mutanten in Langzeit-Chemostatversuchen ist wahrscheinlich ein Ausdruck dieser unnatürlichen Lebensverhältnisse, indem diejenigen Zellen
selektioniert werden, welche unter konstanten Bedingungen eine höhere
spezifische Wachstumsrate besitzen als andere. Solche lange dauernde
konstante Phasen sind jedoch in einer natürlichen Umgebung kaum zu
erwarten. Vielmehr leben mikrobielle Zellen in Habitaten, welche durch
kontinuierliche Veränderungen der physiko-chemischen Parameter
charakterisiert sind. Deshalb besitzen in den natürlichen Habitaten nicht
diejenigen Zellen einen selektiven Vorteil, welche unter konstanten
Bedingungen eine hohe Wachstumsrate aufweisen, sondern diejenigen,
welche sich unter den schwankenden Verhältnissen am besten zurechtfinden.
Die bakterielle Zelle ist in ihrer natürlichen Umgebung oft Situationen ausgesetzt, welche ein metabolisches Ungleichgewicht oder sogar einen
Stresszustand auslösen können. Die Zelle hat deshalb effiziente Mittel
entwickelt, um ihr Wachstum und die damit verbundenen metabolischen
Prozesse an solche Situationen anzupassen. Verschiedene intrazelluläre
Moleküle signalisieren Stressituationen und lösen damit schnelle und wirksame zelluläre Adaptionsmechanismen aus. Zyklisches AMP z.B. signalisiert
Kohlenstoffmangel und die Folge davon sind u. a. Derepression und Induktion anderer katabolischer Systeme, welche einem Kohlenstoffdefizit
entgegenwirken. Andere Signalmoleküle wie Guanosin 5'-Diphosphat 3'Diphosphat (ppGpp) kontrollieren die Proteinsynthese. Die Bedeutung dieser
schnell wirksamen Regulationsmechanismen ist für den Adaptionsprozess
ausserordentlich gross, denn die Eigenschaft der Zelle, sich schnell an die
109
er Selektionswechselnden Bedingungen anzupassen, ist wohl ein pnmar
in einem
Spezie
einer
ben
faktor, welcher massgeblich über das Überle
solchen
unter
ntiert
bestimmten Habitat entscheidet. Der Wildtyp repräse
Lebensbedingungen zweifellos den idealen Genotypen.
Ausblick
reduzierender
Die in dieser Arbeit entwickelte Methode zur Bestimmung
bisherige
Kohlehydrate in biologischen Medien eröffnet die Möglichkeit,
Mikroischen
ökolog
und
en
logisch
Erkenntnisse auf dem Gebiet der physio
biologie zu erweitern.
im steady
Die theoretischen Betrachtungen über Einzelsubstratverwertung
voraus und
state sind dem tatsächlichen Stand dieses Forschungzweiges weit
n Grundentbehren, wie aus der Literatur ersichtlich ist, der experimentelle
lagen in Form handfester Daten.
verwertung
Noch weniger Daten existieren über die Kinetik der Mischsubstrat
rschend
vorher
im steady state. Da Mischsubstratverhältnisse in der Natur
ren
grösse
sind, könnte ein fundiertes Wissen auf diesem Gebiet zum
Verständnis der mikrobiellen Ökologie beitragen.
nicht-steady
Die Regulationstätigkeit der Zelle offenbrut sich vor allem unter
Ergänzung
lle
wertvo
eine
state Bedingungen. Kinetische Messungen können
dieser
rung
Ausfüh
der
zu den biochemischen Erkenntnissen sein. Mit
Rückkönnen
Experimente im umweltrelevanten Konzentrationsbereich
.
werden
n
gezoge
mene
schlüsse auf Umweltphäno
Eine grössere
Auch die Methode selbst scheint noch ausbaufähig zu sein.
chbar.
erwüns
und
ll
sinnvo
Sensitivität ist vor allem für Umweltmessungen
110
5. ZUSAMMENFASSUNG I SUMM ARY
Es wird allgemein angenommen, dass die -spezifische Wachstumsrate von
Mikroorganismen eine Funktion der externen Substratkonzentration ist. In
den meisten Fällen wurde diese Abhängigkeit in Batchkulturen ermittelt,
obwohl die Übertragung solcher Resultate auf steady state Bedingungen
fragwürdig zu sein scheint. Messungen der limitierenden Substratkonzentration in Abhängigkeit der spezifischen Wachstumsrate unter steady state
Bedingungen wurden bisher sehr selten durchgeführt. In Batchkulturen ist es
nicht möglich, Wachstum im Substrat-limitierten Konzentrationsbereich
unter kontrollierten Bedingungen zu untersuchen, da die Substratkonzentration, bedingt durch das bakterielle Wachstum, kontinuierlich abnimmt und
deshalb zu keinem Zeitpunkt konstant bleibt. Das geeignete Instrument, um
bakterielles Wachstum im Substrat-limitierten Bereich zu studieren, ist der
Chemostat, wo die Kulturen bei jeder spezifischen Wachstumsrate zwischen
0 < µ < µmax beliebig lange gehalten werden können. Die Schwierigkeit hier
besteht darin, die Restsubstratkonzentrationen, die meist nur im Spurenbereich vorliegen, genau zu bestimmen. Neben einer hohen Sensitivität muss
die analytische Methode auch ein gewisses Mass an Selektivität erfüllen, da
biologische Wachstumsmedien sehr komplex aufgebaut sind. Der Mangel
entsprechender Daten aus Chemostatkulturen in der Literatur reflektiert das
Fehlen einer tauglichen analytischen Methode. Aus diesem Grund wurde eine
Methode entwickelt, welche fähig war, die Restsubstrate Zucker-limitierter
Chemostatkulturen bis in den µg/l-Bereich zu bestimmen. Dabei wurden die
Zucker entsalzter Chemostatproben mittels HPLC getrennt und anschliessend
amperometrisch detektiert. Die Sensitivität dieser Methode mit einer
Detektionsgrenze für Glucose und Fructose von < 1 ng ist ausserordentlich
gross. Mittels derselben Methode Hessen sich auch Proben aus natürlichen
Gewässern auf ihren Zuckergehalt bestimmen.
Um die Beziehung der Wachstumsrate zur steady state Substratkonzentration
zu beschreiben, wird in den meisten Fällen das Monod-Modell herangezogen.
Die in dieser Arbeit durchgeführten Messungen der Restglucosekonzentrationen einer Glucose-limitierten E. coli-Chemostatkultur bei verschiedenen
Verdünnungsraten ergab jedoch eine Beziehung, die nur schlecht durch das
Monod-Modell beschrieben werden konnte. Die schon des öftern geäusserte
Kritik anl Monod-Modell, nämlich dass die hohen Wachstumsraten erst bei
zu hohen Substratkonzentrationen erreicht wurden, konnte auch hier bestätigt
werden.
111
Bessere Resultate wurden durch eine semi-logarithrnische Beziehung
zwischen den steady state Glucosekonzentrationen und den entsprechenden
Verdünnungsraten erhalten. Diese Beziehung lässt sich durch eine aus der
Nicht-Gleichgewichts-Thermodynamik stammende Theorie interpretieren,
wonach die spezifische Wachstumsrate eine Funktion der Gibb'schen Freien
Energie zwischen dem Substrat und den Produkten des Wachstums ist.
Versuche mit Batchkulturen haben ergeben, dass so erzielte Wachstumskinetiken nicht vergleichbar sind mit solchen aus kontinuierlichen Kulturen.
Die Unterschiede zeigten sich darin, dass die Zellen aus kontinuierlichen
Kulturen im tiefen Substratkonzentrationsbereich effizienter Glucose
verwerteten als die in Batchkulturen wachsenden. Als Grund wurde
angegeben, dass die in Batchkultur wachsenden Zellen nicht optimal an die
betreffenden Substratkonzentrationen adaptiert waren. Da das Monod-Modell
wie auch die übrigen Wachstumsmodelle für steady state Bedingungen
fonnuliert wurden, scheint es berechtigt, nur solche Wachstumskinetiken zu
berücksichtigen, welche in kontinuierlichen Kulturen erzielt wurden.
Die in Kapitel 2.4 beschriebene Methode lässt sich hervorragend für
Mischsubstrateversuche sowohl in Chemostat- als auch in Batchkulturen einsetzen. Ihre hohe Sensitivität mit einer Detektionsgrenze von < 2 ng für die
meisten Monosaccharide erlaubte es, Mischsubstratversuche in Batchkulturen
auch im niedrigen Konzentrationsbereich durchzuführen.
Bei hohen Initialsubstratkonzentrationen wuchs eine E. coli-Batchkultur mit
Glucose und Galactose als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle diauxisch,
bei tiefen hingegen mit simultanem Glucose- und Galactoseabbau. Es konnte
gezeigt werden, dass die Galactoseverwertung in Gegenwart hoher Glucosekonzentrationen inhibiert wurde, wobei wahrscheinlich die extrazelluläre
Glucosekonzentration direkt oder indirekt für diese Inhibition verantwortlich
war. Diese Annahme wird auch dadurch bestärkt, dass in kontinuierlicher
Kultur Glucose und Galactose über den ganzen Bereich der Verdünnungsrate
simultan verwertet wurde, was einen Einfluss der spezifischen Wachstumsrate auf die in Batchkulturen beobachtete Inhibition der Galactoseverwertung
bei hohen Glucosekonzentrationen ausschliesst. Es ist bekannt, dass der
Galactosetransport durch hohe Glucosekonzentrationen durch InducerExclusion inhibiert wird. Die Resultate von Kapitel 3.3 und 3.4 bestätigen
112
diesen Befund, und es konnte gezeigt werden, dass diese Transportinhibition
unterhalb einer Glucosekonzentration von ca. 6-8 mg/l aufgehoben wurde.
Batchkulturen von E. coli mit Glucose und Fructose als einzige Kohlenstoffund Energiequelle zeigten, dass Fructose sowohl bei hohen als auch bei niedrigen Initialsubstratkonzentrationen erst anschliessend an eine längere Glucoseabbauphase abgebaut wurde. Wurde ausgehend von einer bei D =0.5 h-1
wachsenden Glucose-limitierten Chemostatkultur unterbruchslos auf Fructose
gewechselt, so wurde während den ersten Minuten nur wenig Fructose verwertet. Die Inhibition der Fructoseverwertung sowohl in Batch- al'> auch in
Chemostatkultur könnte durch Interaktionen des Glucose-PTS mit dem Fruc-
tose-PTS zustande gekommen sein.
Eine längere Lagphase von ca. 45 Minuten wurde beobachtet, wenn von einer
Glucose-limitierten Chemostatkultur auf Arabinose gewechselt wurde.
Anscheinend Ieichen kleinste Glucosekonzentrationen aus, um den
Arabinoseabbau zu inhibieren. Dieses Resultat ist in Übereinstimmung mit
den Batchversuchen mit Glucose und Arabinose als einzige Kohlenstoff- und
Energiequelle, wo selbst bei niedrigsten Initialsubstratkonzentrationen nach
dem Abbau der Glucose eine längere Lagphase eintrat, ehe mit dem
Arabinoseabbau begonnen wurde.
Als einziger der getesteten Zucker wurde Mannose nach Umstellen einer
Glucose-limitierten auf eine Mannose-limitierte Chemostatkultur unterbruchslos verwertet. Dies ist nicht überraschend, da sowohl das MannosePTS als auch die im Mannoseabbau involvierte Mannose-6-Phosphat
Isomerase während des Glucoseabbaus aktiv sind.
All generally accepted laws of bacterial growth state that growth rate is a
function of the external substrate concentration. Mostly this dependence has
been dete1mined in batch cultures, where real steady state conditions never
occur. Measurements of the limiting substrate concentrations as a function of
the specific growth rate under steady state conditions in chemostat cultures
are rarely documented in the literature. However, the most appropriate culture
technique to study bacterial growth under substrate-limiting conditions is
continuous culture, where the cells can be maintained under constant
conditions over extended periods of time at any growth rate between 0 < µ <
µmax· Concentrations of the residual substrate in continuous culture normally
113
lie within a very low concentration range, making such deterrninations
difficult to carry out. Besides high sensitivity, selective detection is required,
because biological media are very complex. The lack of data from chemostat
cultures reflects the lack of appropriate analytical methods.
In this work an analytic method for quantifying reducing sugars has been
developed, which was sensitive enough to allow detection of residual
concentrations of sugar-lirnited chemostat cultures at the µg/1-range. Sugars
in desalted samples were separated by HPLC and subsequently detected
amperometrically. Tue sensitivity of this method is extraordinarly high; the
detection limit for glucose and fructose is lower than 1 ng. With the same
method, sugars in natural waters can also be deterrnined.
Using this method the residual concentrations of substrate has been
detemlined in glucose-limited chemostat cultures of E. coli as a function of
growth rate. Normally, the relationship between the specific growth rate and
the steady state substrate concentration is described by the Monod-model. In
this work, the experimentally found relationship between the glucose
concentration and specific growth rate of E. coli in glucose-limited chemostat
cultures cannot been explained by the Monod-model over the entire range of
dilution rates. At low dilution rates the results agreed with Monods' model,
whereas at high dilution rates, a departure from the predictions of this model
were observed. The dependence between the specific growth rate and the
steady state glucose concentrations could be best described by a semilogarithmic function. This can be explained using a theoretical approach to
growth derived from non-equilibrium thermodynamics, where the specific
growth rate is a function of Gibb's Free Energy between the substrate and the
products of growth.
lt has been shown in this work, that growth kinetics derived from batch
cultures cannot be compared to those perfmmed in chemostat cultures. The
cells from continuous culture can utilise glucose more efficiently, i. e. to
lower concentrations, at low growth rates than can cells from batch cultures.
This results from the fact that cells growing in batch culture have not adapted
their enzyme machinery optimal for growth at low substrate concentrations.
The utilisation of nlixtures of sugars in batch culture has traditionally been
carried out at high substrate concentrations. To test whether the established
regulatory patterns observed at high concentrations also hold for environmentally relevant concentrations, growth of E. coli with various concentrations of sugars was investigated in batch culture. At high initial substrate
concentrations diauxic growth with glucose an<l galactose as sole carbon- and
114
energy source was observed, however at low concentrations, both glucose
and galactose were utilized simultaneously. lt was shown that galactose
utilization in the presence of high glucose eoncentration was inhibited and
that extracellular glucose was perhaps responsible for this inhibition. This
conclusion was supported by the fact, that continuously cultured cells utilized
both glucose and galactose simultaneously over the entire range of dilution
rates, so that the growth rate can be assumed to be of rninor influence.
Galactose transport is known tobe inhibited by glucose by inducer exclusion.
Our results corroborated this finding and it was shown, that at glucose
concentrations lower than 6-8 mg/l inhibition of galactose utilisation was
relieved.
Batch cultures with glucose and fructose as sole carbon- and energy source
showed fructose utilization to be inhibited at both high concentrations and
low concentrations. In both cases fructose was utilised only after an initial
period of growth with glucose only. Very little fructose was utilized in the
first few rninutes after switching from glucose-limited chemostat culture at a
dilution rate of 0.5 h-1 to fructose as sole carbon and energy source. lt is
probable that in both batch culture and in continuous culture fructose utilisation was inhibited by interactions of the glucose-.PTS with the fructose-.PTS.
A lag phase of around 45 minutes was observed when switching from a
glucose-lirnited chemostat culture at a dilution rate of 0.5 h-1 to arabinose as
sole carbon- and energy source. This result is in accordance with that of batch
cultures with glucose and arabinose as sole carbon- and energy source, where
arabinose was only utilized even at low initial substrate concentrations after
total consumption of glucose and after a significant lagphase.
Mannose was the only of the tested sugars, tliat was utilised immediately
after switching from a glucose-limited chemostat culture at 0.5 h-1 to
mannose-limited growth conditions. Because both, the mannose-.PTS and
mannose-6-phosphate isomerase are active during growth on glucose, this
result was expected.
115
6. LITERATURVERZEICHNIS
se enzyme s of Escherichia
Adhya S „ Echols H. (1966). Glucos e effect and the galacto
and inducer transport. J.
coli: Correla tion betwee n glucose inhibiti on ofindu ction
Bacteri ol. 92:601 .
utilization of dissolv ed organic
Andrew s P „ William s P .J .LEB. ( 1971 ). Heterot rophie
on rates and concen trations of
oxidati
the
of
ement
compo unds in the sea. III. Measur
U .K. 51: 111.
glucose and amino acids in sea water. J. Mar. Biol. Ass.
ntial galacto se utilizat ion in a
Asensi o C., Avigad G„ Horeck er B.L. (1963). Prefere
s. 103:29 9.
nmtant strain of Escherichia coli. Arch. Bioche m. Biophy
ente und Modell e. 2.
Bergter F. (1983). Wachs tum von Mikroo rganism en, Experim
im.
Weinhe
,
Auflag e. Verlag Chemie
Bot.19 :281.
Blackm an F.F. (1905). Optima and limiting factors. Ann.
of Eschel'ichia co/i with a
Böck A„ Neidha rdt F.C. (1966). Isolatio n of a mutant
e activity. J. Bacteri ol. 92:464.
temper ature-s ensitive frnctose 1,6-dip hospha te aldolas
utilization of glucose and fructose
Clark B., Holms W.H. (1976). Contro l ofthe sequen tial
95:191.
iol.
Microb
Gen.
by Escherichia coli. J.
the induced synthes is of the ßCohn M„ Horiba ta K. (1959a ). Inhibiti on by glucose of
is of mainten ance. J. Bacteri ol.
galacto side-en zyme system of Escherichia coli. Analys
78:601 .
tiation and ofthe heterog eneity
Cohn M„ Horiha ta K. (1959b ). Analys is ofthe differen
ß-galac tosidas e synthesis. J.
induced
oing
underg
coli
ichia
Escher
of
within a popula tion
Bacteri ol. 78:613 .
on by glucose of the induced
Cohn M„ Horiba ta K. (1959c ). Physiol ogy of the inhibiti
ichia coli. J. Bacteriol. 78:624 .
synthes is of the ß-galac toside- enzyme system of Escher
(1976). Proton movem ents
Collins S.I-1„ Jarvis A.W„ Lindsa y R.J., Hamilt on W.A.
isolatio n of mutant s with
coli:
ichia
Escher
in
rt
transpo
alanine
and
couple d to lactate
1232.
126:
ol.
Bacteri
J.
rt.
transpo
alanine
in
altered stoichio metry
nship betwee n popula tion
Contoi s D .E. ( 1959). Kinetic s of bacterial growth: Relatio
. J. Gen Microbiol. 21:40.
density and specific growth rate of continu ous culture
Growth stasis by accumu lated
Cozzar elli N.R., Koch J.P„ Hayash i S„ Lin E.C.C. (1965).
1325.
90:
ol.
Bacteri
J.
coli.
ichia
Escher
in
osphate
L-«-gly ceroph
ofsubst rate-lim itecl growth: Tue
Dabes J.N., Finn R.K„ Wilke C.R. (1973). Equatio ns
1159.
15:
.
Bioeng
nol.
case for Blackm an kinetics. Biotech
ls for the charact erisatio n of
Dawso n R„ Liebez eit G. (1981). The analyti cal methoc
Marine Organi c Chemis try.
organic s in seawate r. In: E.K. Duursm a, R. Dawso n (eds.).
p. 445.
Elsevie r Scienti fic Publishi.ng Compa ny, Amster dam,
of «-ami.no acids in seawat er usi.ng
Dawso n R., Pritcha rd R.G. (1978). The clete1mi.nation
6:27.
Chem.
a fluorim etric analyser. Mar.
116
Dean A.C.R. (1972). Influence of envirorunent
Appl. Chem. Biotechnol. 22:245.
011
the control of enzyme synthesis. J.
Dean A.C.R„ Hinshelwood C. (1966). Total Integration. In: Growth, Function and
Regulation in Bacterial Cells. Clarendon Press, Oxford. P. 103.
Degens E.T„ Reuter J.H„ Shaw K.N.F. (1964). Biochemical compounds in offshore
Califomia sedirnents and sea waters. Geochirnica Cosmochintica Acta 28:45.
Dietz G.W„ Heppel L.A. (1971). Studies on the uptake of hexose phosphates. II. The
induction of the glucose 6-phosphate transport system by exogenous but not by
endogenously fonned glucose 6-phosphate. J. Biol. Chem. 246:2885.
Dietzler D.N„ Leckie M.P„ Magnani J.L. (1974). Evidence that ATP exerts control ofthe
rate of glucose utilization in the intact Escherichia coli cell by altering the cellular level of
glucose-6-phosphate, an intermediate known to inhibit glucose tra.nsport in vitro.
Biochem. Biophys. Res. Comm. 60:622.
Dills S.S„ Apperson A., Schmidt M.R., Saier M.H., Jr. (1980). Carbohydrate transport in
bacteria. Microbiol. Rev. 44:385.
Dvorak H.F„ Brockman R.W„ Heppel L.A. (1967). Purification and properties oftwo acid
phosphatase fractions isolated from osmotic shock fluid of Escherichia coli. Biochemistry
6:1743.
Epps H.M.R„ Gale E.F. (1942). Tue influence of the presence of glucose during growth
on the enzyme activities of Escherichia co/i: Comparison of lhe effect with tliat produced
by fem1entation acids. Biochem. J. 36:619.
Fraenkel D.G. (1968a). The accumulation of glucose 6-phosphate from glucose and its
effect in an Escherichia coli muta.nt lacking phosphoglucose isomerase and glucose 6phosphate dehydrogenase. J. Biol. Chem. 243:6451.
Fraenkel D .G. ( l 968b ). Tue phosphoenolpyruvate-ini tiated pathway offructose
metabolism in Escherichia coli. J. ßiol. Chem. 243:6458.
Fraenkel D.G„ Falcoz-Kelly F„ Horecker B.L. (1964). Tue utilisation of glucose 6phosphate by glucokinaseless and wild-type strains of Escherichia coli. Biochemistry
52:1207.
Ganesan A.K„ Rotman B. (1965). Transportsystems for galactose and galactosides in
Escherichia coli. J. Mol. Biol. 16:42.
Gaudy A.F„ Jr. ( 1962). Studies
Appl. Microbiol. 10:264.
011
induction and repression in activated sludge systems.
Gocke K„ Dawson R„ Liebezeit G. (1981 ). Availability of dissolved free glucose to
heterotrophic microorganisms. Mar. Bio!. 62:209.
Guidi-Rotoni C„ Danchin A., Ullmann A. (1980). Catabolite repression in Escherichia
coli mutauts lacking cyclic AMP receptor protein. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77:5799.
Guidi-Rotoni C„ Danchin A., Ulhnann A. (1982). Pleiotropic expression of catabolic
operons in the absence of the cAMP-CAP complex: 'flte case of tlle maltose regulon. Ami.
Microbiol. 133A:81.
117
Haguenauer R„ Kepes A. (197J ). The cycle of intracellular a-methyl glucoside
accumulated by the glucose pennease of Escherichia coli. Biochimie 53:99.
Handa N., Yanagi K. (1966). Studies on water-extractable carbohydrates ofthe particulate
matter from north-west Pacific Ocean. Mar. Biol. 4:197.
Hanson R.B., Snyder J. (1979). Enzymatic <letennination of glucose in marine environments: Improvement and note of caution. Mar. Chem. 7:353.
Harder W., Kuenen J.G„ Matin A. (1977). Microbial selection in continuous culture. J.
Appl. Bacteriol. 43: 1.
Harder W., Dijkhuizen L. (1976). Mixed substrate utilization. In: A.C.R. Dean, D.C.
Ellwood, C.G.T. Evans, J. Melling (eds.). Continuous Culture ans New Fields. Bilis
Horwoo<l, Chichester, p. 297.
Harder W„ Dijkhuizen L. (1982). Strategies ofmixed substrate utilization in microorganisms. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 297:459.
Harris D.W., Feather M.S. (1972). An intramolecular hydrogen transfer during the
conversion of D-glucose to 2-(hydroxyacetyl)-furan. Tetrahedron Lett. 47:4813.
Harris D.W„ Feather M.S. (1975). Studies on the mechanism of the interconversion of Dglucose, D-mannose, and D-fructose in acid solution. J. Am. Chem. Soc. 97:1.
Harrison D.E.F„ Topiwala H.H. (1974). Transient and oscillatory states of continuous
culture. Adv. Biochem. Eng. 3:107.
Henderson P.J.F. (1986). Active transport of sugars into Escherichia coli. In: Morgan I„
Michael J. (eds.) Carbohydrate Metabolism in Cultured Cells. Plenum Press, New York, p.
409.
Herbert D. (1961 ). Tite chemical composition of micro-organisms as a function of their
environment. Symp. Soc. Gen. Microbiol. 11:391.
Herbert D., Komberg H.L. ( 1976). Glucose transport as rate-limiting step in the growth of
Escherichia coli on glucose. Biochem. J. 156:477.
Hicks S.E„ Carey F.G. (1968). Glucose detennination in natural waters. Limnol. Oceanog.
13:361.
Heppel L.A. (1969). The effect of osmotic shock on release of bacterial proteins and on
active transpo1t. J. Gen. Physiol. 54:95s.
Höfle M.G. (1983). Long-tenn changes in chemostat cultures of Cytophaga johnsonae.
Appl. Environ. Microbiol. 46:1045.
Hofsten B„ v. (1961). Acid phosphatase and the growth of Escherichia coli. Biochim.
Biophys. Acta48:171.
Horecker B.L., Thomas J., Monod J. (1960a). Galactose transport in Escherichia co/i. I.
General properties as studied in a galactokinaseless nmtant. J. Bio!. Chem. 235: 1580.
Horecker B.L., Thomas J., Monod J. ( l 960b). Galactose transport in Escherichia coli. II.
Characteristics of the exit process. J. Bio!. Chem. 235: 1586.
118
Hunter I.S„ Komberg H.L. (1979). Glucose transport of Escherichia coli growing in
glucose-limi ted continuous culture. Biochem. J. 178:97.
IernsaJimsky N.D. (1967). MicrobiaJ Physiology and·Continu ous Culture, H.M.S.O„
London. p. 23.
Ingraham J.L„ Maaloe 0., Neidhardt F.C. (1983). Growth ofthe BacteriaJ Cell. Sinauer
Ass„ lnc„ Sunderland U.S.A.
Jshida Y., Imai I„ Miyagaki T„ Kadota H. (1982). Growth and uptake kinetics of a
facultatively oligotrophic bacterium at low nutrient concentrations. Microbiol. Ecol. 8:23.
Jannasch H.W. (1968). Competitive elimination of Enterobacter iaceae from seawater.
Appl. Microbiol. 16:1616.
Josefsson B. 0. ( 1971). Detenninatio n of soluble carbohylh·ates in sea water by partition
chromatogra phy after desaJting by ion-exchange membrane electrodialysis. Anal. Chim.
Acta 52:65.
Kaback H.R. ( 1969). Regulation of sugar transport in isolated bacterial membrane
preparations from Escherichia coli. Physiology 63:724.
Koch A.L„ Wang C.H. (1982). How close to the theoretical diffusion limit do bacterial
uptake systems function?. Arch. Microbiol. 131:36.
Konings W.N., Veldkamp H. ( 1983). Energy transduction and solute tnmsport
mechanisms in relation to environments occupied by microorganis ms. In: Slater J.1-1.,
Whittenbury R„ Wimpenny J.W.T. (eds.) Microbes in their natural environment s.
Cambridge University Press, Cambridge. P. 153.
Komberg H.L. (1973). Fine control of sugar uptake by Escherichia coli. Symp. Soc. Exp.
Biol. 27: 175.
Komberg H.L., Reeves R.E. (1972). Inducible phosphoenol pyruvate-dep endent hexose
phosphotrans ferase activities in Escherichia coli. Biochem. J. 128:1339.
Komberg H.L., Riordan C. (1976). Uptake of galactose into Escherichia coli by facilitated
diffusion. J. Gen. Microbiol. 94:75.
Lehmann J. ( 1976). Chemie der Kohlenhydrate. Monosaccha ride und Derivate. Georg
Thieme Verlag Stuttgart, 1976.
Lengeler J. (1966). Untersuchun gen zum Glucose-Effe kt bei der Synthese der GalaktoseEnzyme von Escherichia coli. Z. Vererbungs!. 98:203.
Lin E.C.C. (1976). Glycerol dissirnilation and its regulation in bacteria. Annu. Rev.
Microbiol. 30:535.
Lin E.C.C. (1987). Dissimilatory pathways for sugars, polyols, and carboxylates. In:
Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Am. Soc. Microbiol. Vol 1:244.
MacKinnon M.D. (1981). Tue measuremen t of organic carbon in sea water. In: E.K.
Duursma, R. Dawson (eds.). Marine organic chemistry. Elsevier Scientific Publishing
Company, Amsterdam, p. 415.
119
Magasanik B. (1961). Catabolite repression. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.
26:249.
Makman, R.S„ Sutherland E.W. (1965). Adenosin 3', 5'-phosphate in Escherichia coli. J.
Biol. Chem. 240:1309.
Mason T.J„ Millis N.F. ( 1976). Growth kinetics of a yeast grown on glucose or
hexadecane. Bioteclmol. Bioeng.18:1337.
Mateles R.I., Chian S.K„ Silver R. (1967). continuous culture on mixed substrates. In:
Powell E.O., Evans C.G.T„ Strange R.E., Tempest D.W. (eds.) Microbial physiology and
Continuous Culture, London H.M.S.O„ p 232.
Matin A. ( 1979). Microbial regulatory mechanisms at low nutrient concentrations as
studied in chemostat. In: Shilo M. (ed.). Strategies of Microbial Life in Extreme
Environments. Berlin: Dahlem Konferenzen, p. 323.
McGinnis J .F., Paigen K. ( 1969). Catabolite inhibition: A general phenomenon in the
control of carbohydrate utilization. J. Bacteriol. 100:902.
Meyenburg K„von (1971). Transport-limite<l growth rates in a mutant of Eschel'ichia coli.
J. Bacteriol. 107:878.
Monod J. ( 1942). Recherches sur la croissance des cultures bacteriennes. Paris:Hermann et
Cie.
Monod J. (1949). The growth of bacterial cultures. A.tm. Rev. Microbiol. 3:371.
Monod J. (1950). La technique de culture continue. Theorie et applications. A.tm. Inst.
Pasteur 79:390.
Mopper K. ( 1977). Sugars am! uronic acids in sediment and water from the Black Sea and
North Sea with emphasis on analytical techniques. Mar. Chem. 5:585.
Mopper K. ( l 978a). Tmprovecl chromatographic separations on anion-exchange resins. 1.
Partition Chromatography of sugars in ethanol. A.ttal. Biochem. 85:528.
Mopper K. (1978b). Improved chromatographic separations on anion exchange resins. III.
Sugars in borate medium. A.t1al. Biochem. 87:162.
Mopper K., Dawson R., Liebezeit G., Ittekott V. (1980). The monosaccharide spectra of
natural waters. Mar. Chem. 10:55.
Moser H. (l 958). The dynamics of bacterial populations maintained in the chemostat.
Washington, D.C.: The Ca.rnegie Institution.
Neal J.L. (1972) Analysis ofMichaelis kinetics for two independent, saturable membrane
transport functions. J. Theor. Biol. 35:113.
Neijssel O.M., Hueting S„ Tempest D.W. (1977). Glucose transport capacity is not the
rate-litniting step in the growth of some wild-type strains of Escherichia coli and
Klebsiel/a aeroge11es in chemostat culture. FEMS Microbiol. Lett. 2:1.
Neijssel O.M„ Tempest D.W. (1976). Bioenergetic aspects of aerobic growth of Klebsiella
aeroge11es NCI'C 418 in carbon-limited and carbon-sufficient chemostat culture. Arch.
Microbiol. 107:215.
120
(1982). Phosphoenolpyruvate:sugar
Nels on S.O„ Scholte B.J„ Postma P.W. ation of carbohydrate metabolism in Salmonella
regul
d
phosphotransferase system-mediate
typhimurium. J. Bacteriol. 150:604.
g the
se of enzymes from Escherichia coli durin
Neu H.C„ Heppel L.A. (1965). The relea
685.
240:3
Chem
Biol.
J.
ts.
formation of spheroplas
ia coli
duction of ß-galactosidase by Escherich
Novick A„ Horiuchi T. ( 1961 ). Hyper-pro t. Biol. 26:239.
Quan
.
bacteria. Cold Spring Harbour Symp
tions
ts with the chemostat on spontaneous muta
Novick A„ Szilard L. (1950). Experimen
. 36:708.
ofbac teria . Proc. Nat. Acad. Sei„ U.S.A
ia
L-arabinose permease system in Eschel'ich
Novotny C.P„ Englesberg E. (1966). lbe
17.
117:2
Acta
coli B/r. Biochim. Biophys.
erization ofD- gluco se. J. Org. Chemistry
Ohno Y„ Ward K. Jr. (1961). Acid Epin1
26:3928.
lation of lactose petm ease activity by the
of the
Osumi T„ Saier M.H „ Jr. (1982). Regu
rase system: Evidence for direct binding
ansfe
photr
phos
ar
e:sug
ruvat
phosphoenolpy
Natl. Acad. Sei. U.S.A.
Proc.
ease.
penn
se
lacto
the
to
lll
me
glucose-specific enzy
79:1457.
MP: Stimulation of ß-galactosidase and
Perlman R„ Pastan I. (1968). Cyclic 3'5'-A Biophys. Res. Comm. 30:656.
em.
tryptophanase induction in E. coli. Bioch
Regulation
erichia coli adenylat cyclase complex:
Peterkofsky A„ Gazdar C. (1979). Esch
. Sei. U.S.A. 76: 1099.
Acad
Natl.
Proc.
ent.
gradi
l
mica
roche
by the proton elect
and Cell Cultivation. Blac kwel l Scientific
Pirt S.J. (1975). Principles of Microbe
Publications, Oxford.
phoenolpyruvat:carbohydrate
Postma P.W„ Lengeler J.W. ( 1985). Phos obiol. Rev. 49:232.
Micr
ria.
bacte
of
m
syste
rase
ansfe
phosphotr
bacterial phosphoenolpyruvate:sugar
Postm a P.W„ Roseman S. (1976). The
hys. Acta 457:213.
Biop
in1.
Bioch
m.
phosphotransferase syste
e
croor ganis ms as a function ofsub strat
Powell E.O. (1967). The growth rate ofmi
on; p. 34.
Lond
.S.O„
H.M
re,
Cultu
s
inuou
Cont
concentration. Microbial Physiology and
toside in
second penn ease for methyl-thio-ß-galac
Presticlge L.S„ Pardee A.B. (1965). A
100:591.
Escherichia coli. Biochem. Biophys. Acta
n in
of ß-galactoside phosphate accumulatio
Reizer J„ Panos C. (1980). Regulation
. Sei. USA
Acad
Natl.
Proc.
.
anism
mech
lsion
expu
Streptococcus pyrogenes by an
77:5497.
for
substrate concentration determinations
Robertson B.R„ Button D.K. (1977). Low 14C-glucose analysis by glucose oxidase thin
ii.
es.
studi
ic
kinet
th
grow
ed
nutrient limit
3:35.
layer chromatography. Mar. Sei. Comm.
ent of
a P.W„ Van Drun K. (1987). fatab lishm
Rutgers M„ Texe ira de Mattos M..T„ Postm culture of Klebsiella pneumoniae. J. Gen.
ostat
chem
the steady state in glucose-limited
Microbiol. 133:445.
121
rate tran spor t in bact eria .
sms and regu latio n of carb ohyd
Saie r M.H „ Jr. (198 5) Mec hani
Aca dem ic Pres s, lnc. 1985.
te:su gar
a W.K. ( 1977). Sug ar pho spha
Saie r M.H. Jr„ Feuc ht B.U „ Mor grou p tran sloc atio n cata lyze d by the enzy me II
ange
tran spho spho ryla tion and exch
rans fera se syst em. J. Biol.
phoe nolp yruv ate:s ugar phos phot
com plex es of the bact eria l phos
Che m. 252: 8899 .
spho ryl moi ety of mm mito l
( 1976). Dire ct tran sfer of the pho
es ofth e
Saie r M.H . Jr„ New man M.J.
plex
com
II
me
enzy
cata lized by the
ntia ru1d
1-ph osph ate to [14C jma nnit ol
se syst ems in Spir ocha eta aura
fera
rans
phot
phos
itol
rum
phos phoe nolp yruv ate:m
. Chem. 251: 3834 .
Salmonella typhimurium. J. Biol
path way s for suga r upta ke by
1). Com peti tion betw een two
Scho lle B.J„ Post ma P.W. (198
syst em in Salmonella
se
sfera
rru1
phot
phos
r
nden t suga
the phos phoe nolp yruv ate- depe
114: 51.
typhimurium. Eur. J. Bioc hem .
conc entr atio n, grow th
Rela tion ship betw een subs trate
Schu lze K.L „ Lipe R.S. (1964). erichia coli in cont inuo us culture. Arch . Mik robi ol. 48: 1.
rate, and resp irati on rate of Esch
n on the grow th of
). Effe ct of nutr ient conc entr atio
She hata T.E „ Mar r A.G. ( 1971
210.
Escherichia coli. J. Bacteriol. 107:
ems in Escl1erichia coli. In:
W. (1978). Sug ar tran spor t syst Yor k, Bas el, p.12 7.
Silh avy T.J„ Fere nci T„ Boo s
New
Inc„
ker,
Dek
cel
1sport. Mar
Ros en B .P. (ed.) Bac teria l Trru
e stru ctur e of cell
2). The fluid mos aic mod el ofth
Sing er S.J„ Nico lson G.L. (197
membrru1es. Scie nce 175: 720.
h- ru1d cont inuo us-c ultu re
„ Tsu chiy a H.M. ( 1972). Batc
Stancling C.N „ Fred rick son A.G . App l. Mic robi ol. 23:3 54.
ems
trru1sients for two subs trate syst
n on the utili zatio n of
cts of inhi hitio n and repressio
ol. 14:6 54.
Stum m-Z ollin ger E. ( 1966). Effe
robi
Mic
l.
App
eria l conu nuni ties.
subs trate s by hete roge neou s bact
ces com plex es. Ann .
quan titat ive de quel ques croi ssan
Teis sier G. (1936a). Des crip tion
Phy siolo gie 10:3 59.
. Phy siolo gie 12:5 27.
ltitatives de la croissance. Ann
Teis sier G. (1936b). Les lois quru
fonn atio n of pho spha tase s by
of inorganic pho spha te in the
Torr iani A. ( 1960). fnfluence
60.
hys. Act a 38:4
Escherichia coli. Biochin1. Biop
siolo gica l phen ome na?.
AM P effe cts relatecl to real phy
llllm ann A. (1974). Are cycl ic
m. 57:3 48.
Bioc hem . Biop hys. Res. Com
9.
repr essi on 1985. Bioc hirn ie 67:2
Ulh nann A. (1985). Cata boli te
Tue occu renc e ru1d role of
asch H.W „ Care y F.G. (196 8).
Vac caro R.F „ Hicks S.E„ Jann mog r. 13:3 56.
Oce
gluc use in seawater. Limnol.
cing carb ohy drat es in
Amp erom etric dete ctio n of redu
Wat anab e N„ lnou e M. (1983). m. 55:1016.
Che
liqu id clu·omatography. Anal.
. Z. Allg. Mik robi ol.
Verw ertu ng von Mis chsu bstr aten
Wei de H. (1983). Mik robi elle
23:37.
122
Westerhoff H.V„ Lolkema J.S„ Otto R„ Hellingwerf K.J. (1982). Thennodyna mics of
growth. Non-e4uilibrium thennodynam ics of bacterial growth. Tue phenomenolo gical
and mosaic approach. Biochim. Biophys. Acta 683: 181.
Wetzei B.K., Spicer S.S„ Dvorak H.F., Heppel L.A. (1970). Cytochemica l localisation of
cerlain phosphatases in Escherichia coli. J. Bacteriol. 104:529.
Winkl er H. H. ( L970). Compartmentation in the induction of the hexose-6-phosphate
transpo1i system of Escherichia coli. J. Bacteriol. 101:470.
Wu H.C.P. ( 1967). Role of the galactose transport system in the estahlishment of
endogenous induction of the galactose operon in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 24:213.
Wu H.C.P„ Boos W„ Kalckar H.M. (1969). Role of the galactose transport system in the
retention of intracellular galactose in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 41: 109.
Wu H.C.P„ Kalckar H.M. (1966). Endogenous induction of the galactose operon in
Escherichia coli Kl2. Proc. Nat. Acad. Sei„ Wash. 55:622.
Cun-iculum vitae
1959-64 besuchte ich die
Ich wurde am 15. Juli 1952 in Zürich geboren. Von
Gymnasium der Freien
Primarschule in Allschwil (BL) und von 1964-70 das
der Ev. Mittelschule in
Ev. Schule in Basel. Nach einem Zwischenjahr an
Minerva, Basel, auf die
Schiers bereitete ich mich von 1971-74 im Institut
Maturität (Typus B). Mit
Maturität vor. Im Herbst 1974 bestand ich die eidg.
ntrum der Universität
Bioze
dem Studium begann ich im Herbst 1975 am
Biologie wechselte .
sche
Basel, von wo ich nach zwei Semestern in die klassi
marbeit mykologischen
.hn Jahre 1982 schloss ich das Studium mit der Diplo
1983 immatrikulierte
Themas unter der Leitung von Dr. U. Gisi ab. Im Jahre
Nachdiplomstudium in
ich mich an der ETH Zürich und absolvierte das
WAG in Dübendorf.
EA
der
an
"Siedlungswasserbau und Gewässerschutz"
lung Technische
Abtei
der
Tm Herbst 1984 begann ich die Dissertation an
r.
Hame
Biologie der EA WAG unter der Leitung von Prof. G.