Globuline

Proteine III
SDS-PolyacrylamidGelelektrophorese
Serumproteine


ca. 100 verschiedenen Proteine im Blutplasma; stammen aus Leber
und Lymphknoten;
Gesunder Organismus: dynamisches Gleichgewicht zwischen
Biosynthese und Abbau von Plasmaproteinen

Hypoproteinämie – zu niedriger Plasmaproteinspiegel
Ursachen: - verringerte Biosynthese (vermindertes
Aminosäureangebot oder Leberparenchymschäden)
- vermehrte Ausscheidung
- Nierenschädigung

Hyperproteinämie – zu hoher Plasmaproteinspiegel
durch vermehrte Biosynthese; meist klonale Expansion von gGlobulin produzierenden Plasmazellen
Fraktionen der Serumproteine I

Bestimmung der gesamten Proteinkonzentration besitzt nur
beschränkte Aussagekraft – Auftrennen der Plasmaproteine in
Einzelfraktionen  diagnostische Hinweise

Grundsätzlich kann man Plasmaproteine in 5 Fraktionen trennen:
1) Albumine
2) a1-Globuline
3) a2-Globuline
4) b-Globuline
5) g-Globuline
Analyse der Serumproteinfraktionen I

Die Trägerelektrophorese wird
meist routinemäßig (,screening
method‘) bei Verdacht auf
bestimmte Krebstypen
durchgeführt.

Nach der elektrophoretischen
Auftrennung kann man 5
gefärbte Banden (Albumin und
Globuline) erkennen.
Analyse der Serumproteinfraktionen II
Abb.1

Zur genaueren Analyse können die
Banden eingescannt und mittels
Bildanalyseprogrammen berechnet
werden (Abb.1).
Abb.2

Am wichtigsten ist die Erkennung
abnormer Eiweißstoffe, sog.
Paraproteine (Abb.2).
Paraproteine können Indikatoren für
Blutkrebs sein.
Albumin

hohe Fähigkeit zur Wasserbindung  wichtiger Regulator des
kolloidosmotischen Drucks

Transportvehikel für Pharmaka, Vitamine, Magnesium, Calcium, nichtveresterte Fettsäuren, Spurenelemente, Abbau- und toxische Produkte
im Blut

in der Leber synthetisiert und anschließend in den Extrazellulärraum
sezerniert; 40% befinden sich im Plasma, 60% im Extrazellulärraum des
Hautgewebes

Stark erniedrigte Albuminwerte deuten auf schwere Leberleiden,
Leberzirrhose oder Nephrose hin.
a1-Globuline

Saures a1-Glycoprotein:
kohlenhydratreichstes Serumprotein; als Akute-Phase-Protein an der
Immunmodulation beteiligt; liegt besonders bei akuten und chronischen
Entzündungen, bei Carcinomen und während der Schwangerschaft in
hohen Konzentrationen vor.

a1-Fetoprotein:
im fetalen Plasma, beim gesunden Erwachsenen nur in Spuren
vorhanden; bindet Östrogen, könnte den Fetus vor einem Überschuss an
mütterlichem Östrogen schützen.
Bei Patienten mit Leberzellkarzinomen oder Hodentumoren findet die
Biosynthese von a1-Fetoprotein in den Tumorzellen statt und wird von
denen ins Plasma abgegeben.
Weiters gehören zur α1 Fraktion: Proteaseinhibitoren, Hormon-bindende
Proteine, α1 Lipoprotein (HDL), und Prothrombin.
a2-Globuline / b-Globuline

a2- Gobuline sind ,Carrier-Moleküle‘ - binden und transportieren
bestimmte Stoffe (Haptoglobin bindet Hämoglobin, Coeruloplasmin
ist das Transportmolekül für Kupfer). Weiters findet man unter den
a2- Gobulinen Thrombin-Inhibitoren, Plasmin-Inhibitoren und das
Proenzym Plasminogen.

Zu den b-Globulinen zählt man





Transferin (bindet und transportiert Eisenmoleküle)
Fibrinogen (Fibrinvorstufe – dient der Blutgerinnung)
CRP (C-reaktives Protein): fördert die Phagozytose, indem es
Makrophagen und das Komplementsystem aktiviert. CRP steigt bei
Entzündungen 10-1000fach an und wird zu den Akute-PhaseProteinen gezählt.
b-Lipoprotein (low densitiy lipoprotein-LDL), für den Lipidtransport
Faktoren des Komplementsystems
g-Globuline

Bei den g-Globulinen (Immunglobulinen) handelt es sich um Antikörper; man
unterscheidet fünf Immunglobulinklassen:
IgG, IgA, IgM, IgD und IgE

g-Globuline werden von zu Plasmazellen ausgereiften B-Zellen produziert. Sie
zirkulieren im Blut, befinden sich aber auch an der Oberfläche von allen BLymphozyten, wo sie als Membranrezeptoren für Antigene wirken.

g-Globulin-Erhöhung bei:
 Längerdauernden entzündlichen Prozessen (Infektionen;
Autoimmunerkrankungen: z.B. Rheuma; maligne Tumoren)
 Lebererkrankungen, besonders Leberzirrhose
 Erhöhte Produktion von g-Globulinen durch Blutkrebserkrankungen
Akute-Phase-Reaktion
Gewebsverletzung
Unspezifische
Entzündungsreaktion
Erhöhte Plasmakonzentration
von Akute-Phase-Proteinen
(meist in Hepatocyten
gebildet)
Regulation der Synthese
durch Cytokine, die von
Entzündungszellen gebildet
werden
Bei Stress: Corticosteroide;
wirken als Cofaktoren
Elektrophorese

Elektrophorese ist die Wanderung geladener Teilchen in
einem elektrischen Feld.

Zur Erzeugung des elektrischen Feldes wird das ganze
Elektrophorese-System in einen Puffer getaucht und
Spannung angelegt. Über die im Puffer enthaltenen Ionen
fließt Strom.

Dabei wandern positiv geladene Teilchen (Kationen) zur
Kathode (-) und negativ geladene Teilchen (Anionen) zur
Anode (+).

Die Mobilität dieser Teilchen wird von mehreren Faktoren
beeinflußt:
- Form und Größe
- Nettoladung
- Porengröße des Trägers
- Stärke des elektrischen Feldes
- Reibung
Wanderungsgeschwindigkeit I

Die Wanderungsgeschwindigkeit nimmt für größere Moleküle ab, da z.B
Reibungskräfte im Gel zunehmen.

Moleküle ähnlicher Größe, aber unterschiedlicher Form, können
unterschiedliche Wanderungseigenschaften aufweisen, da
Reibungskräfte und elektrostatische Kräfte unterschiedlich angreifen.
Wanderungsgeschwindigkeit II
Ohmsches Gesetz:
U
I=
R
I = Stromstärke (in Ampere A)
U = Spannung (in Volt V)
R = Widerstand (in Ohm W)
Wanderungsgeschwindigkeit III
E
z
v =
f
v = Wanderungsgeschwindigkeit des Teilchens
E= elektrische Feldstärke
z = Nettoladung des Teilchens
f = Reibungskoeffizient
SDS-PAGE
Sodiumdodecylsulfat Polyacrylamidgel-Elektrophorese




häufige Methode um Proteingemische zu trennen und die
Größe von Proteinen abzuschätzen
Detergens (SDS) bindet im Überschuss an die Proteine im
Proteingemisch (etwa 1,4g SDS / 1g Protein). Alle Proteine
tragen daher eine beständig negative Ladung und wandern
zum positiven Pol, der Anode.
Infolge der Molekularsiebeigenschaften des
Polyacrylamidgels bewegen sich die Proteine unterschiedlich
schnell. Je grösser ein Protein, desto langsamer wird es
durch die Maschen des Polyacrylamidgels gezogen.
Läßt man Eichproteine mit bekanntem Molekulargewicht
mitlaufen, so kann man das Molekulargewicht der
unbekannten Proteine bestimmen.
-200kD
-116kD
-97kD
-66kD
-45kD
-31kD
-21.5kD
-14.4kD
Polyacrylamidgele als Trägermedien

Die Wanderung von Proteinen aufgrund des
elektrischen Feldes wird durch das Gel
größenabhängig abgebremst. Moleküle, die im
Verhältnis zu den Gelporen klein sind, wandern schnell,
Moleküle, die größer sind als die Poren, sind nahezu
unbeweglich.

Polyacrylamid wird in der Elektrophorese gerne als
Trägersubstanz verwendet, da :
- es chemisch inert ist
- es sich leicht herstellen läßt
- die Porengröße leicht zu variieren ist
Polyacrylamidgele

Polyacrylamidgele sollten kurz vor Gebrauch
hergestellt werden.

Das Monomer Acrylamid wird mit einem
quervernetzenden Agens -meist N,N`Methylenbisacrylamid (Kurzform: ,Bis‘) mit Hilfe
eines Radikalbildners (Ammoniumpersulfat)
und eines Katalysators (TEMED) polymerisiert.

Die Porengröße wird durch das Verhältnis der
Konzentration des Acrylamid-Monomers zu der
des Quervernetzungsagens Bis bestimmt.
SDS

Dient dazu, die Proteine zu denaturieren,
da es fast alle nicht-kovalenten
Wechselwirkungen in nativen Proteinen
zerstört. Erhitzen auf 95°C löst alle Tertiär –
und Sekundärstrukturen auf.

Die SDS-Anionen binden sich an die
Hauptketten der denaturierten Proteine,
sodaß Komplexe mit einer stark negativen
Ladung entstehen.

Um noch vorhandene Disulfidbrücken zu
reduzieren, gibt man 2-Mercaptoethanol oder
Dithiothreitol (DTT) zu.
Probenvorbereitung

Die Proben enthalten neben SDS und 2-Mercaptoethanol noch Glycerin
oder Saccharose, um die Dichte zu erhöhen, und Bromphenolblau als
Markierungsfarbstoff.

Vor dem Laden der Gele werden die Proben für 10 min. aufgekocht,
damit alle Proteine vollständig denaturiert werden und auch hydrophobe
Proteine in Lösung gehen.
Diskontinuierliches Puffersystem I

Die Diskontinuierliche (Disk -) Elektrophorese wurde von U.K.Laemmli
eingeführt

Bei der Disk -Elektrophorese wird die Gelmatrix in 2 Bereiche geteilt:
1) weitporiges Sammelgel
2) engmaschiges Trenngel

Die Disk - Elektrophorese hat 2 Vorteile:
1) Aggregation von Proteinen bei Eintritt in das Gel wird verhindert
2) Schärfung der Banden
Diskontinuierliches Puffersystem II
Diskontinuierliches Puffersystem II
Probe
Sammelgel
Trenngel
Diskontinuierliches Puffersystem II
Andere Proteingel-Typen

Gradienten – Gele:




Native Proteingele




SDS-frei
Sekundär- und Tertiärstruktur bleibt erhalten
Wanderung der Proteine durch ihre Eigenladung
Nicht reduzierende Proteingele



Eignen sich, wenn man auf einem Gel Proteine mit sehr unterschiedlichen
Grössen auftrennen will
Porenweite verringert sich mit der Gellänge
Trennschärfe in jedem Bereich sehr gut
Ohne DTT oder 2-Mercaptoethanol
Disulfidbrücken und somit Quartärstruktur bleiben erhalten
Nachteile von nativen und nicht reduzierenden Gelen



Neigung zur Aggregatbildung
Schlechte Auflösung
Schlechte Reproduzierbarkeit
Praktisches
Glasplatte mit Spacer
Spacer (1mm)
Deckplatte
Glasplatten
mit Leitungswasser putzen und
mit Haushaltspapier gründlich trockenwischen
Halterung für Glasplatten
Festklemmen der Glasplatten
Kontrolle
Glasplatten müssen plan aufliegen
?
Gießständer vorbereiten
Einspannen
Moosgummiunterlage
Moosgummiunterlage
mit Leitungswasser reinigen
und trockenwischen
Gießen des Trenngels
Gießen bis ca. 3mm unter
dem „grünen Balken“
Überschichten mit Butanol
Polymerisation
Gießen des Sammelgels
Gießen bis zur Oberkante
Einführen des Kamms
Polymerisation
Glasplatten mit polymerisiertem Gel
Einsetzen der Glasplatten in die Gelapparatur
Einspannen
Füllen des Kathodenraums
mit Elektrodenpuffer
Gel
Kathodenpuffer
Glasplatten
Kochen (Erhitzen) der Probe
Füllen der Slots (unterschichten) mit Probe
Gel
Kathodenpuffer
Einsetzen in die Pufferkammer
Befüllen des Anodenraumes
mit Elektrodenpuffer
Gel
-
Seitliche Ansicht
+
Elektrodenpuffer
Elektrophorese
Entfernen der Glasplatten
Färben und Entfärben des Gels
Nachweismethoden

Elektrophoretisch aufgetrennte Proteine können mit Hilfe von
Färbemethoden sichtbar gemacht werden.

Coomassie-Brilliant-Blue
Das Gel wird dabei in eine Lösung aus Coomassie-BrilliantBlue und 10% Essigsäure eingelegt. Die Proteine werden
gefärbt und gleichzeitig durch die Essigsäure fixiert.
Nachweisgrenze: 0,5-1mg
stöchiometrische Färbung

Silverstain
Ag+Ionen werden durch schwefelhältige und basische
Aminosäuren zu metallischem Silber reduziert.
Die Färbung ergibt rotbraune bis schwarze Spots.
Empfindlichere Methode mit einer Nachweisgrenze
von ca.10ng
nicht-stöchiometrische Färbung
Wissenswertes
Wenn der Strom keine mechanische oder chemische
„Arbeit leistet“, wird die von der Stromquelle aufgenommene
Energie als Wärme abgegeben
U=IxR
Mobilität
Beschleunigende Kraft auf ein Teilchen:
F (beschleunigend) = q (Ladung) x E (Feldstärke)
Bremsende Kraft auf ein Teilchen:
F (bremsend) = f (Reibungskoeffizient) x v (Geschwindigkeit)
P
P
P
P=Proteine
P
P
P
Elektro-Osmotisches Feld (EOF):
Ist eine durch (Gegen) Ladungen
bedingte (Puffer) Gegenströmung
Praktische Probleme
•Hohe Ionenstärke bedeutet geringen spezifischen Widerstand
•Hohe Ionenstärke bedeutet hohe spezifische Leitfähigkeit
•Hohe Ionenstärke bedeutet hohe Stromstärke
•Hohe Stromstärke bedeutet hohe Wärmeentwicklung
•Wärme – Dissoz. – mehr Ionen – mehr Strom – mehr Wärme.....
Wärme
E(Feldstärke) = Fc(Coulomb-Kraft)/Q(Ladung)
Feldstärke
Die elektrische Feldstärke ist eine vektorielle Größe (Coulomb….), die
jedem Punkt des Raumes eindeutig einen bestimmten Betrag und eine
bestimmte Richtung des elektrischen Feldes zuordnet.
Sie beschreibt die Fähigkeit des elektrischen Feldes, Kraft auf Ladungen
auszuüben, und ist in einem gegebenen Punkt definiert durch
q steht für eine kleine Probeladung, die sich am gegebenen Punkt befindet. ist die auf diese
Probeladung wirkende Kraft. Diese Definition ist wegen der Proportionalität von Kraft und Ladung
sinnvoll. Der Grenzwert beschreibt die reale physikalische Existenz der elektrischen Feldstärke,
auch wenn die Probeladung entfernt wird bzw. gegen Null geht.
Konstante elektrische Parameter
Folgende Parameter können konstant gehalten werden:
Stromstärke (A)
Spannung (U)
Leistung (P)
Im elektrischen Feld wandern Probe-Ionen und Puffer-Ionen
Verwendung von Puffertanks an beiden Elektroden als Pufferreservoirs
Puffer darf sich nicht „erschöpfen“
Anteil der Probe-Ionen soll möglichst hoch sein
(Optimierung der Wanderungsgeschwindigkeit der Probeionen)
Gering konzentrierter Elektrophoresepuffer (aber noch puffernd)