Sedimentation, Elektrophorese

Sedimentation,
Elektrophorese
MEDIZINISCHE PHYSIK UND STATISTIK 2.
Dr. Tamás Huber
Institut für Biophysik
17. März 2016.
Trennungsmethoden
Trennverfahren in der Chemie oder Physik helfen dabei,
zwei oder mehr Stoffe von einander zu trennen.
ZENTRIFUGATION
ELEKTROPHORESE
CHROMATOGRAPHIE
Biomoleküle können getrennt werden aufgrund ihrer
chemischen Eigenschaften:
Ladung, Löslichkeit, Wechselwirkung
mit spezifischen Reagenzien, Molmasse
physikalischen Eigenschaften:
Volumen, Dichte, Struktur
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Einfache Trennungstechniken
Beim Sedimentieren lässt man eine mit einem unlöslichen
Feststoff verunreinigte Flüssigkeit, zum Beispiel eine
Suspension, länger stehen, wobei sich der Feststoff als
Sediment absetzt. Das Abgießen der überstehenden
Flüssigkeit heißt Dekantieren.
Die beiden Verfahren werden
im Haushalt angewandt,
wenn man den Kaffee vom
Kaffeesatz abgießt.
Sedimentation passiert in dem Gravitationsfeld (g)!
Zentrifugation
In dem Gravitationsfeld sind nur die aufgelösten Teilchen
zwischen 2-50 μm fähig, zu sedimentieren.
Um kleinere Moleküle zu sedimentieren, ist eine stärkere
Feldstärke nötig.
Blut vor (rechts) und nach
(links) dem Zentrifugieren
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Zentrifugen
Auf die Partikeln wirkende Kräfte in dem
Zentrifugationskraftfeld
Zentrifugationskraftfeld = beschleunigtes Koordinatensystem
Zentrifugalkraft:
ω
v
FZ
m, ρ
Fz = mrω 2
Auftriebskraft:
FA
FR
FA = ρ 0Vg = ρ 0
m
ρ
rω 2
Reibungskraft:
FR =
FZ ist dem Schwerefeld proportional
FZ nimmt im Verlauf der Sedimentation zu
FA wirkt FZ entgegen
FA ist abhängig vom Lösungsmittel
FR wirkt FZ entgegen
f ist abhängig von Form, Größe und Hydratation der Partikel
fv
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Sedimentationskoeffizient
FR = FZ - FA
fv = mrω 2 − ρ0
 ρ 
rω 2 = mrω 2 1 − 0 
ρ
 ρ
m
Der Sedimentationskoeffizient S (Svedberg) beschreibt die Sinkgeschwindigkeit
von Teilchen in der Ultrazentrifuge im Verhältnis zur Zentrifugalbeschleunigung.
(1 −
=
)
Einheit:
=
10−13 s = 1S [Svedberg]
Aus dem Sedimentationskoeffizienten lässt sich bei Kenntnis des
Diffusionskoeffizienten die Molmasse des gelösten Teilchens berechnen:
=
=
1−
(1 −
)
=
=
~
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Einstein-Stokes-Gleichung
Differentielle Zentrifugation
Separierte Zellkomponenten auf der Basis von Größe und Dichte.
Homogenisierung:
Die Plasmamembran der Zellen wird zerstört:
- mit Ultraschall
- mit osmotischem Schock
- mit mechanischen Methoden
Überstand
Niederschlag
Zellkerne sedimentieren bei Zentrifugation mit 1000 g für 5 - 10 Min;
Mitochondrien, Lysosomen, Peroxisomen mit 10.000 g für 15 Min und
Mikrosomen, andere Vesikeln, Polymeren (z.B: Aktin Filamente) mit 100.000 g für
eine Stunde.
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Dichtegradientenzentrifugation
(Isopyknische oder Gleichgewichtszentrifugation)
Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation (Glyzerin, Perkoll) ist (z. B. von
10% bis auf 30% Saccharose) schon vor Beginn der Zentrifugation eingestellt.
Die Auftrennung der Stoffgemische erfolgt entsprechend den Svedberg-Werten:
Moleküle mit hohem S-Wert sedimentieren rascher als solche mit geringerem
S-Wert.
Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation von den
Zellen des Wildtyps und einer Mutante.
CsCl-Dichtegradienten-Zentrifugation zur
Isolierung von Plasmid-DNA
Bei der Aufreinigung von DNA im Caesiumchlorid-Gradienten werden
Nukleinsäuren anhand ihrer Dichte getrennt.
Das Prinzip der Trennung von chromosomaler und Plasmid-DNA erfolgt während der
Zentrifugation in Gegenwart von Ethidiumbromid. Ethidiumbromid interkaliert zwar
auch in Doppelstrang-DNA wie die kovalent geschlossene ringförmige Form (supercoil)
des Plasmids, jedoch lagern lineare DNA-Doppelstränge oder durch einen
Einzelstrangbruch geöffnete Plasmide (nicked circled-DNA) erheblich mehr
Ethidiumbromid ein, was die Schwimmdichte dieser DNA-Formen erhöht.
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Noch ein Beispiel…
Elektrophorese
Trennverfahren im elektrischen Feld
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Die Bewegung des geladenen Teilchens
im elektrischen Feld
Coulomb-Kraft:
FC = QE = ZeE
v
+
FR
Fc
+
F
E = elektrische Feldstärke
e = elementare Ladung
Z = Zahl der Ladungen
−
Reibungskraft:
E
FR = fv
v = Wanderungsgeschwindigkeit
f = Reibungskoeffizient
Wie lange werden sich die Teilchen beschleunigen?
ZeE = fv
FC = FR
Die elektrophoretische Mobilität
Von der Feldstärkeneinheit bewirkte Wanderungsgeschwindigkeit:
uel =
v Ze
=
E
f
Kugelförmiges Molekül:
ZeE = 6πηruel
(Stokes-Gesetz)
uel =
Ze
6πηr
Das Maß des Moleküls ist bestimmbar!
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Agarose Gel-Elektrophorese
Agarose (Polisaccharid) stellt die Hauptkomponente
des Agars (aus den Rotalgen-Gattungen) dar. Es
wird für Separation von Protein Komplexen, DNA und
RNA verwendet.
Rotalgen
Unter UV Licht
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Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE)
Die Gelelektrophorese wird zur Charakterisierung von Proteinen und zur
Überprüfung von deren Reinheit eingesetzt.
In einer radikalen Reaktion
mit APS als Starter wird
hierbei ein vernetztes
Polymer gebildet.
Der Vernetzungsgrad (und damit auch die
Porengröße) ist von der
Acrylamidkonzentration abhängig, die
Polymerisationsgeschwindigkeit von der
Temperatur und vom pH-Wert.
Detergenz SDS zerstört die Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur der Proteine.
- Nicht-kovalente Proteinaggregate werden aufgelöst
- Proteine bewegen sich im Gel annähernd proportional zu ihrer Größe
Da SDS negativ geladen ist, ist das Verhältnis von
Ladung zu Größe für jedes Protein annähernd gleich.
Durch den Vergleich mit einem Gemisch, das Proteine
bekannter molekularer Massen enthält (der ProteinStandard), lässt sich die molekulare Masse
unbekannter Proteine im Gel bestimmen.
Arbeitet man unter reduzierten
Bedingungen (Erhitzen, Zugabe von
Dithiothreitol oder Mercaptoethanol),
werden die Disulfidbrücken der
Proteine gespalten.
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Proteinfärbung
Nachdem die Elektrophorese durchgeführt wurde, werden die Proteinbanden
angefärbt. Dies geschieht meist durch den anionischen Farbstoff CoomassieBlau. Dieser bindet an hydrophobe Bereiche der Proteine und macht diese somit
sichtbar. Die Proteine werden vorher im Gel fixiert.
Eine weitere Möglichkeit der
Proteinfärbung ist die Silberfärbung.
IEF – Isoelektrische Fokussierung
Wanderung der Proteine durch Gel mit pH-Gradient bis zum PI.
Stagnation am PI.
Konzentrierungseffekt wirkt Diffusion entgegen.
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2D - Gelelektrophorese
Serum-Eiweißelektrophorese
Chronische Entzündung
Normalbefund
Antikörper-Mangel Syndrom
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DANKE FÜR IHRE
AUFMERKSAMKEIT!
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