Syphilis Total Ab 1 Platte - 96 72530 5 Platten - 480 72531 - Bio-Rad

Syphilis Total Ab
1 Platte - 96
5 Platten - 480
72530
72531
SYPHILIS TOTAL AB IST
ENZYMIMMUNOASSAY ZUM QUALITATIVEN
NACHWEIS VON ANTIKÖRPERN GEGENTREPONEMA PALLIDUM IN
HUMANSERUM ODER –PLASMA.
883679 - 2014/11
INHALTSVERZEICHNIS
1.
VERWENDUNGSZWECK ......................................................................... 2
2.
ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG DES TESTS........................ 2
3.
TESTPRINZIP .......................................................................................... 2
4.
REAGENZIEN .......................................................................................... 3
5.
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN .................................... 4
6.
PROBEN .................................................................................................. 5
7.
TESTDURCHFÜHRUNG ........................................................................... 6
8.
TESTEINSCHRÄNKUNG .......................................................................... 9
9.
LEISTUNGSMERKMALE .......................................................................... 9
10.
LITERATUR ........................................................................................... 1 2
[DE] 1
1. VERWENDUNGSZWECK
Diese Kits sind zur Verwendung von entsprechend geschultem und qualifiziertem Personal für den
qualitativen Nachweis von Antikörpern gegen Treponema pallidum in Humanserum und -plasma
bestimmt. Das Produkt kann zum Screening von Blutspendern und bei der Diagnose von Patienten
mit Verdacht auf Syphilis-Infektion verwendet werden.
2. ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG DES TESTS
Syphilis ist eine chronische Infektion mit stadienhaftem Verlauf (Primär-, Sekundär-, Tertiär- und
Quartärstadium). Diese Stadien sind durch verschiedene klinische Symptome gekennzeichnet.
Typisch ist zunächst die Bildung von als Schanker bekannten Läsionen und eines syphilitischen
Ausschlags, auf die anschließend eine ggf. lange Latenzzeit folgt. Unbehandelte Infektionen können
zu kardiovaskulären Problemen und Neurosyphilis führen.
Die Infektion wird von dem Spirochäten Treponema pallidum verursacht und erfolgt in der Regel durch
sexuellen Kontakt. Die Krankheit kann aber auch durch die Transfusion von infiziertem Blut
übertragen werden. Es sind auch Fälle einer intrauterinen Infektion bekannt. Bislang war es praktisch
nicht möglich, den Erreger in künstlichen Medien anzuzüchten, sodass die Diagnose der Infektion
meist auf dem Nachweis von Antikörpern im Blut beruht. Diese Antikörper erscheinen kurz nach der
Erstinfektion und können viele Jahre persistieren.
Tests zum Nachweis von Syphilis fallen in vier Kategorien: direkte mikroskopische Untersuchung,
Tests auf Antikörper gegen Treponema, Tests auf andere Antikörper und direkte Antigentests.
Aufgrund der langen Latenzzeit und der Unspezifität von Nicht-Treponema-spezifischen-Tests werden
immer häufiger Methoden zum Nachweis spezifischer Antikörper gegen Treponema im Blut
angewendet. Der Syphilis Total Ab ist einer dieser Tests.
3. TESTPRINZIP
Der Syphilis Total Ab verwendet drei rekombinante Antigene in einem Sandwich-Assay. Die Antigene
ermöglichen den Nachweis von IgG, IgM und IgA, die gegen T. pallidum spezifisch sind. Der Test
kann zum Antikörpernachweis in allen Infektionsstadien angewendet werden.
Die Vertiefungen sind mit einem Gemisch aus rekombinanten Antigenen von T. pallidum der Größe 15
kD, 17 kD und 47 kD beschichtet. In Serum- bzw. Plasmaproben vorhandene spezifische Antikörper
binden an diese Antigene sowie an dieselben Antigene, die mit Meerrettichperoxidase konjugiert sind,
wenn das Konjugat einer Vertiefung zugegeben wird, in welcher die Probe inkubiert worden ist. Nach
der Entfernung von ungebundenem Material durch Waschen wird das Vorhandensein von
gebundenem Enzym durch einen Farbumschlag in dem Substrat/Chromogen-Gemisch angezeigt und
weist auf das Vorhandensein spezifischer Antikörper in der Patientenprobe hin. Um auf das
Vorhandensein bzw. Fehlen von Antikörpern schließen zu können, wird die Intensität der Farbe mit
der in Kontrollvertiefungen verglichen.
[DE] 2
4. REAGENZIEN
4.1. Beschreibung
Kennzeichnung auf
dem Etikett
Beschreibung
Mikrotiterplatte
12 Streifen mit je 8 Vertiefungen,
beschichtet mit
rekombinanten Antigenen von T.
pallidum (rAg)
Spezifische ID-Nummer = 97
Konzentrierte Waschlösung (20fach konzentriert)
Tris NaCl-Puffer pH 7,4
Konservierungsmittel: ProClin™
300 (0,04%)
Negativkontrolle
Tris-Puffer mit BSA (bovines
Serumalbumin)
Konservierungsmittel: ProClin™
300 (0,1%)
Positivkontrolle (human)
Humanserum mit Antikörpern
gegen T.pallidum, negativ auf
HIV1/2, HBs-Ag und HCV,
verdünnt in einem Tris-Puffer mit
BSA (bovines Serumalbumin)
Konservierungsmittel: ProClin™
300 (0,1%)
Konjugat
T.pallidum-rAg/Peroxidase
Konservierungsmittel: ProClin™
300 (0,05%)
Darreichungsform
72530
Darreichungsform
72531
1 Platte
Gebrauchsfertig
5 Platten
Gebrauchsfertig
1 Flasche
70 ml
Zum Verdünnen
1 Flasche
235 ml
Zum Verdünnen
1 Flasche
2,1 ml
Gebrauchsfertig
1 Flasche
2,1 ml
Gebrauchsfertig
1 Flasche
1,6 ml
Gebrauchsfertig
1 Flasche
1,6 ml
Gebrauchsfertig
1 Flasche
8 ml
Gebrauchsfertig
1 Flasche
30 ml
Gebrauchsfertig
R1
Microplate
R2
Concentrated
Washing
Solution
(20X)
R3
Negative
control
R4
Positive
control
R6
Conjugate
R8
Substrate
buffer
Substratpuffer
Zitronensäure und
Natriumacetatlösung, pH 4,0 mit
H2O2 (0,015 %) und DMSO (4 %)
1 Flasche
60 ml
Zum
Rekonstituieren
1 Flasche
60 ml
Zum
Rekonstituieren
R9
Chromogen:
TMB solution
(11X)
Chromogen: TMB-Lösung (11fach konzentriert)
Lösung mit 3.3’, 5.5’Tetramethylbenzidin (TMB)
1 Flasche
5 ml
Zum Verdünnen
1 Flasche
5 ml
Zum Verdünnen
R10
Stopping
solution
Stopplösung
Schwefelsäurelösung (H2SO4 1N)
1 Flasche
28 ml
Gebrauchsfertig
1 Flasche
28 ml
Gebrauchsfertig
4.2. Anforderungen an Handhabung und Lagerung
Dieses Kit sollte bei +2-8 °C gelagert werden. Jeder bei +2-8 °C aufbewahrte Bestandteil des Kits
kann bis zum auf der Packung angegebenen Verfallsdatum verwendet werden (sofern nicht anders
angegeben).
Nach dem Öffnen und bei Nichtvorhandensein einer Kontamination können die bei +2-8 °C
aufbewahrten Reagenzien R3, R4, R6, R8, R9 und R10 bis zu dem auf dem Etikett angegebenen
Verfallsdatum verwendet werden.
[DE] 3
Inhalt
Aufbewahrung
R1
Nach dem Öffnen des vakuumversiegelten Beutels können die in ihrem
sorgfältig wieder verschlossenen Originalbeutel bei +2-8 °C aufbewahrten
Mikrowell-Streifen 1 Monat lang verwendet werden.
R2
Die verdünnte Waschlösung kann 2 Wochen bei +2-30 °C gelagert werden.
Die konzentrierte Waschlösung (R2) kann bei +2-30 °C gelagert werden.
R8 + R9
Nach der Rekonstitution sind die Reagenzien lichtgeschützt bei
Raumtemperatur (18-30 °C) bis zu 6 Stunden haltbar.
5. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN
In-vitro-Diagnostikum. Nur zur Verwendung durch medizinisches Fachpersonal.
5.1. Hygiene- und Sicherheitsvorschriften:
Die Handhabung dieses Testkits sollte qualifiziertem Personal vorbehalten sein, das in der
Anwendung von Labortechniken geschult und mit deren möglichen Risiken vertraut ist.
Geeignete Schutzkleidung, Handschuhe und/oder Augen-/Gesichtsschutz tragen und bei der
Handhabung nach der einschlägigen guten Laborpraxis vorgehen.
Das Testkit enthält Bestandteile aus menschlichem Blut. Das für die Herstellung dieser
Reagenzien verwendete menschliche Ausgangsmaterial wurde mit negativem Ergebnis auf
das Vorhandensein von Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg), Antikörpern gegen
Immunschwächeviren (HIV-1 und HIV-2) und Antikörpern gegen das Hepatitis-C-Virus
(HCV) untersucht. Mit keiner heute bekannten Testmethode kann mit absoluter Sicherheit
ausgeschlossen werden, dass Infektionserreger vorhanden sind. Alle Humanblutderivate,
Reagenzien und Humanproben sind daher so zu handhaben, als ob sie
Infektionskrankheiten übertragen könnten, und es sind die in lokalen, regionalen und
nationalen Richtlinien empfohlenen universellen Vorsichtsmaßnahmen für Blutpathogene
einzuhalten.
Biologische Verschmutzungen: Verschmutzungen humanen Ursprungs sind als potenziell
infektiös zu behandeln.
Säurefreie Verschmutzungen sollten unverzüglich mit einem geeigneten chemischen
Desinfektionsmittel, das für die mögliche Biogefährdung durch die betreffenden Proben
geeignet ist (üblicherweise 1:10 verdünnte haushaltsübliche Bleichelösung, 70-80%iges
Ethanol oder Isopropanol, ein Iodophor [z. B. 0,5%iges Wescodyne™ Plus, etc.]),
dekontaminiert und anschließend trocken gewischt werden. Hierbei sind sowohl der
verschmutzte Bereich, verschmutztes Material und alle kontaminierten Oberflächen oder
Geräte einzuschließen.
Säurehaltige Verschmutzungen müssen entsprechend aufgenommen (aufgewischt) oder
neutralisiert und der Bereich anschließend mit Wasser gespült und trocken gewischt werden.
Das zum Aufnehmen der Verschmutzung verwendete Material muss unter Umständen als
infektiöser Abfall entsorgt werden. Anschließend ist der Bereich mit einem der chemischen
Desinfektionsmittel zu dekontaminieren.
HINWEIS: Bleichehaltige Lösungen nicht autoklavieren!
Alle Proben und sämtliches Material, das zur Durchführung des Tests verwendet worden ist,
als infektiöses Material entsorgen. Chemischer und infektiöser Laborabfall ist in
Übereinstimmung mit allen geltenden Vorschriften zu handhaben und zu beseitigen.
Bezüglich Empfehlungen zu Risiken und Vorsichtsmaßnahmen in Zusammenhang mit
einigen Chemikalien in diesem Testkit sind das/die Piktogramm(e) auf den Etiketten und die
Angaben am Ende der Gebrauchsanweisung zu beachten.
Das Sicherheitsdatenblatt ist auf www.bio-rad.com erhältlich.
[DE] 4
5.2. Vorsichtsmaßnahmen in Zusammenhang mit dem Verfahren
5.2.1. Vorbereitung
Die Zuverlässigkeit der Ergebnisse hängt von der Einhaltung folgender GLP
-Richtlinien ab:
• Die Reagenzien nicht über das Verfallsdatum hinaus verwenden.
• Keine Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen in einem Testansatz vermischen oder miteinander
verwenden.
• Alle Reagenzien vor Gebrauch mindestens 30 Min. auf Raumtemperatur bringen.
• Die Bezeichnung des Tests sowie eine spezifische Identifikationsnummer für den Test sind auf dem
Rahmen jeder Mikrotiterplatte angegeben. Diese spezifische Identifikationsnummer steht auch auf
jedem Streifen.
Syphilis Total Ab: Spezifische ID-Nummer = 97
Die spezifische Identifikationsnummer muss vor dem Gebrauch überprüft werden. Sollte die
Identifikationsnummer fehlen oder sich von der dem Assay entsprechenden angegebenen Nummer
unterscheiden, darf der Streifen nicht verwendet werden.
ANMERKUNG: Für die Waschlösung (R2, Etikett: 20x, grün), den Peroxidase-Substratpuffer (R8,
Etikett: TMB-Puffer, blau), das Chromogen (R9, Etikett: TMB, 11x, violett) und die Stopplösung (R10,
Etikett: 1 N, rot) können Chargen aus unterschiedlichen Kits miteinander verwendet werden, sofern
immer die gleiche Charge für einen bestimmten Testansatz verwendet wird. Diese Reagenzien
können mit einigen anderen Produkten unserer Firma verwendet werden. Auskunft hierzu erteilt Ihnen
unsere Supportabteilung.
• Reagenzien vorsichtig auflösen und jegliche Kontamination vermeiden.
• Sorgfältig gewaschene und mit entionisiertem Wasser gespülte Glasgefäße oder vorzugsweise
Einwegmaterial verwenden.
• Die Mikrotiterplatte nach Beendigung des Waschvorgangs und vor dem Pipettieren der Reagenzien
nicht trocknen lassen.
• Die Enzymreaktion weist gegenüber Metallionen eine hohe Sensitivität auf. Daher dürfen
Metallelemente nicht mit den verschiedenen Konjugat- und Substratlösungen in Berührung kommen.
• Die Entwicklungslösung (Substratpuffer + Chromogen) muss pink gefärbt sein. Ändert sich wenige
Minuten nach der Auflösung diese pinke Verfärbung, darf das Reagenz nicht verwendet werden und
muss ersetzt werden.
Die Entwicklungslösung kann in sauberen Einwegblotwannen aus Kunststoff oder in Glasgefäßen
vorbereitet werden, die zuvor mit 1N HCl gewaschen und mit destilliertem Wasser gründlich gespült
und getrocknet wurden. Dieses Reagenz muss lichtgeschützt aufbewahrt werden.
• Niemals das gleiche Gefäß zum Pipettieren des Konjugates und der Entwicklungslösung verwenden.
5.2.2.
Abarbeitung
• Das Testverfahren darf nicht geändert werden.
• Den Test nicht durchführen, wenn Staub oder reaktive Dämpfe (saure, alkalische, Aldehyd-Dämpfe)
vorhanden sind, die zu Veränderungen der Enzymaktivität des Konjugats führen können.
• Für jede Probe eine neue Pipettenspitze verwenden.
• Das Waschen der Vertiefungen ist bei diesem Testverfahren von großer Bedeutung: Die
vorgeschriebenen Waschzyklen sind unbedingt einzuhalten. Die Vertiefungen müssen vollständig
gefüllt und dann vollständig geleert werden. Nicht vorschriftsmäßiges Waschen kann zu ungenauen
Ergebnissen führen.
• Die beschriebenen Waschanleitungen sorgfältig befolgen, um eine optimale Leistung des Tests zu
erreichen. Bei einigen Geräten kann es erforderlich sein, den Waschvorgang zu optimieren (Anzahl
der Waschzyklen und/oder Menge des Waschpuffers für jeden Zyklus erhöhen), um einen
akzeptablen OD-Hintergrund für negative Proben zu erreichen.
• Informationen zu Anpassungen und Sondervorgängen erhalten Sie direkt bei uns.
6. PROBEN
Die Entnahme der Blutprobe erfolgt unter Beachtung anerkannter Technik.
Der Test sollte mit unverdünntem Serum oder Plasma (in EDTA, Natriumcitrat, Natriumheparin oder
ACD gesammelt) durchgeführt werden.
[DE] 5
Proben, die Gerinnsel enthalten, müssen vor dem Test durch Zentrifugation geklärt werden. Die
Proben sollten bei 2-8 °C gelagert werden, sofern das Testen innerhalb von 7 Tagen erfolgt,
andernfalls sollten sie bei -20 °C tiefgefroren aufbewahrt werden. Die Proben nicht öfters als fünfmal
einfrieren und wieder auftauen. Proben, die 0,5 Std. bei 56 °C wärmebehandelt worden sind, können
verwendet werden.
Proben, die bis zu 120 g/l Albumin, 200 mg/l Bilirubin, 33 g/l Triolein oder 2 g/l Hämoglobin enthalten,
haben keinen Einfluss auf die Ergebnisse Es wird jedoch nicht empfohlen, hyperlipämisches oder
hyperhämolysiertes Serum oder Plasma zu verwenden.
Die Proben sind vor dem Testen aufzutauen und gut zu mischen.
Zum Transport sind die Proben gemäß den Bestimmungen für den Transport infektiöser Stoffe zu
verpacken. Die Proben vorzugsweise tiefgefroren transportieren.
7. TESTDURCHFÜHRUNG
7.1. Zusätzlich benötigtes Material
• Destilliertes Wasser
• Natriumhypochlorit (Haushaltsbleiche) und Natriumbicarbonat
• Saugfähige Papiertücher
• Einweghandschuhe
• Schutzbrille
• Einwegröhrchen
• Automatische oder halbautomatische Pipetten mit einstellbare oder voreingestellte Volumen sowie
Multipipetten zum Abmessen und Pipettieren von 50 μl, 1 ml und 10 ml.
• Geeichte Zylinder der Größe 100 ml und 1000 ml.
• Automatisches, halbautomatisches oder manuelles Mikrotiterplatten-Waschsystem (*).
• Inkubator für Mikrotiterplatten mit Temperaturregelung, auf 37 °C ± 1 °C einstellbar (*).
• Behälter für infektiösen Abfall
• Mikrotiterplatten-Lesegerät, mit 450 nm-, 490 nm- und 620-700 nm-Filtern ausgestattet (*)
(*) Genaue Auskunft über empfohlene Geräte erteilt Ihnen unsere Supportabteilung.
7.2. Vorbereitung der Reagenzien
7.2.1. Gebrauchsfertige Reagenzien
Reagenz 1 (R1): Mikrotiterplatte
Jeder Rahmen mit 12 Streifen ist in einem versiegelten Folienbeutel verpackt. Den Beutel mit einer
Schere oder einem Skalpell 0,5 - 1 cm über der Versiegelung abschneiden. Den Beutel öffnen und
den Rahmen herausnehmen. Die unbenutzten Streifen wieder in den Beutel zurückgeben. Den Beutel
sorgfältig verschließen und bei +2-8 °C lagern.
Reagenz 3 (R3): Negativkontrolle
Reagenz 4 (R4): Positivkontrolle
Reagenz 6 (R6): Konjugat
Vor der Verwendung durch Umdrehen homogenisieren.
Reagenz 10 (R10): Stopplösung
7.2.2. Zu rekonstituierende Reagenzien:
Reagenz 2 (R2): Konzentrierte Waschlösung (20x)
Um die gebrauchsfertige Waschlösung herzustellen, im Verhältnis 01:20 mit destilliertem Wasser
verdünnen.
800 ml für eine Platte mit 12 Streifen vorbereiten.
[DE] 6
Reagenz 8 (R8) + Reagenz 9 (R9): Enzymentwicklungslösung:
Das Chromogen (R9) 1:11 in Substratpuffer verdünnen (z. B. 1 ml Reagenz R9 + 10 ml Reagenz R8),
Für 12 Streifen werden 10 ml benötigt.
7.3. Testverfahren
Das Testverfahren strikt befolgen.
Für jeden Test sind negative und positive Kontrollseren zu verwenden, um die Qualität des Tests zu
ermitteln.
Es sind folgende GLP-Richtlinien einzuhalten:
1) Probenverteilung und Identifikationsplan sorgfältig festlegen.
2) Die verdünnte Waschlösung R2 vorbereiten.
3) Den Rahmen und die benötigte Anzahl an Streifen (R1) aus der Schutzpackung nehmen.
Unbenutzte Streifen zurück in die Packung geben. Den Beutel verschließen und bei +2-8 °C
lagern.
4) Die Verteilung in den Vertiefungen erfolgt in dieser Reihenfolge (empfohlene
Plattenverteilung):
• 50 µl der Negativkontrolle (R3) in die Vertiefungen A1, B1, C1
• 50 µl der Positivkontrolle (R4) in D1, E1
• 50 µl unverdünnte Probe in jede Vertiefung F1, G1 etc.
• 50 µl Konjugat 1 (R6) in jede Vertiefung
Je nach System ist es möglich, die Position der Kontrollen oder die Verteilungsreihenfolge zu
verändern.
Das Reaktionsgemisch durch mindestens 3 Aspirationsvorgänge oder auf einem
Mikrotiterplattenschüttler für 5 Sekunden homogenisieren.
ANMERKUNG:
Die Verteilung von Proben und Kontrollen kann in diesem Arbeitsschritt visuell überprüft werden,
da sich leere Vertiefungen und Vertiefungen mit Probe farblich unterscheiden.
Das Konjugat nach der Probenzugabe innerhalb von 5 Minuten pipettieren. Es gibt einen
deutlichen Farbunterschied zwischen leeren Vertiefungen und Vertiefungen, die bereits rote
Konjugatlösung (R6) e nt ha lt e n (siehe § 7.7)
5) Sofern möglich, die Mikrotiterplatte mit frischer Klebefolie abdecken.
6) Die Mikrotiterplatte 30 bis 35 Minuten bei 37 °C ± 1 °C inkubieren.
7) Die Klebefolie gegebenenfalls entfernen. Den Inhalt aller Vertiefungen in einen Behälter für
Flüssigabfall absaugen und mindestens 370 µl Waschlösung in jede Vertiefung geben. Erneut
aspirieren und den Waschschritt mindestens 4 Mal wiederholen (sodass insgesamt 5
Waschschritte durchgeführt werden). Die Menge der Rückstände darf nicht mehr als 10 µl
betragen (ggf. die Streifen umdrehen und auf einem Papiertuch ausklopfen).
Bei Verwendung eines Waschautomaten ist derselbe Zyklus einzuhalten.
ANMERKUNG: Den Waschschritt innerhalb von 20 Minuten durchführen.
8) Die Entwicklungslösung (R8+R9) vorbereiten.
9) 50 µl der frisch vor der Verwendung hergestellten Entwicklungslösung (R8+R9) schnell in alle
Vertiefungen geben. Für die Entwicklung der Reaktion die Platte lichtgeschützt bei
Raumtemperatur (18-30 °C) 25 bis 35 Minuten stehen lassen. Während dieser Inkubation
keine Klebefolie verwenden.
ANMERKUNG: Die Verteilung der pinkfarbenen Entwicklungslösung kann bei diesem Schritt
optisch kontrolliert werden. Es gibt einen deutlichen Farbunterschied zwischen leeren
Vertiefungen und Vertiefungen, die bereits pinkfarbene Entwicklungslösung enthalten (siehe
Abschnitt 7.7).
10) 50 µl Stopplösung (R10) in der gleichen Reihenfolge und mit der gleichen Verteilungsmenge
wie die Substratlösung verteilen. Die Reaktionsmischung homogenisieren.
[DE] 7
ANMERKUNG: Die Verteilung der farblosen Stopplösung kann bei diesem Schritt optisch
kontrolliert werden: Die Substratfarbe (pink bei negativen Proben bzw. blau bei positiven Proben)
verblasst in den Vertiefungen, die nach Zugabe von Stopplösung farblos (negative Proben) oder
gelb (positive Proben) werden.
11) Den Boden der Platte sorgfältig abwischen. Bis zum Ablesen des Ergebnisses nach Zugabe
der Stopplösung mindestens 4 Minuten warten, die optische Dichte jedoch innerhalb von
30 Minuten nach Stoppen der Reaktion mit einem Plattenleser bei 450/620-690 nm ablesen.
12) Alle Ergebnisse hinsichtlich der Übereinstimmung zwischen den spektrophotometrischen und
den visuellen Werten sowie gegen die Platten- und Probenverteilung und die
Identifikationspläne prüfen.
7.4. Qualitätskontrolle
Verwenden Sie zum Validieren der Testergebnisse für jede Messreihe die Negativkontrolle (R3) und
die Positivkontrolle (R4) (siehe Abschnitt 7.5).
7.5. Kriterien für die Testvalidierung
Dieser Test ist valide, wenn die folgenden Bedingungen erfüllt sind:
1) Negativkontrolle R3:
OD R3 ≤ 0,080
Wenn ein Wert der Dreifachbestimmung über diesem Wert liegt, ist die Berechnung lediglich mit den
beiden anderen Negativkontrollwerten durchzuführen.
2) Positivkontrolle R4:
OD R4 ≥ 0,700
7.6. Berechnung/Interpretation der Ergebnisse
Der Cut-Off wird mit der Negativkontrolle R3 bestimmt:
Den mittleren gemessenen Absorptionswert der Negativkontrolle R3 bestimmen und anschließend
den Cut-Off (COV) errechnen:
COV = Mittelwert OD R3 + 0,100
Proben mit einer OD unter dem COV gelten als negativ im Syphilis Total Ab.
Ergebnisse, die knapp unter dem Cut-Off liegen (COV -10 % < OD < COV) sollten jedoch mit Vorsicht
interpretiert werden. Die entsprechenden Proben sollten in Doppelbestimmung erneut getestet
werden, sofern die Systeme und Laborverfahren dies erlauben.
Proben mit einem OD, der dem COV entspricht oder höher ist, gelten im Syphilis Total Ab als positiv
und sollten vor der endgültigen Befundung in Doppelbestimmungen erneut getestet werden.
Wenn mindestens ein Wert der Doppelbestimmungen bei Testwiederholungen über dem COV liegt,
gilt die jeweilige Probe als positiv und sollte weiter abgeklärt werden. Proben, bei denen die Werte
beider Doppelbestimmungen unter dem Cut-Off liegen, sind als negativ zu betrachten.
Bei Proben mit einer sehr niedrigen Extinktion (negative OD) und nach Überprüfung der Zugabe von
Probe und Reagenz können die Ergebnisse als negativ interpretiert werden.
Es wird empfohlen, die positiven Proben nach den aktuellen nationalen Leitlinien und Algorithmen zu
bestätigen.
7.7. Spektrophotometrische Überprüfung der Proben- und Konjugatpipettierung
(optional)
Proben und Kontrollen
Das Vorhandensein von Proben und Kontrollen in den Vertiefungen kann durch automatisches Lesen
bei 450/620 nm überprüft werden.
Eine Vertiefung, in der sich Probe befindet, hat einen OD-Wert zwischen 0,050 und 1,100.
[DE] 8
Konjugat
Das Konjugat ist rot.
Das Vorhandensein von Konjugat in den Vertiefungen kann durch automatisches Lesen bei 450/620
nm überprüft werden. Eine Vertiefung, in der sich Probe und Konjugat befinden, hat einen OD ≥1,200.
Überprüfung der Pipettierung der Entwicklungslösung
Das Vorhandensein von pinkfarbener Entwicklungslösung in den Vertiefungen kann durch
automatisches Ablesen bei 492 nm überprüft werden:
Bei einer Vertiefung, die Entwicklungslösung enthält, muss die OD über 0,100 liegen (eine niedrigere
OD weist auf eine unzureichende Pipettierung der Entwicklungslösung hin).
8. TESTEINSCHRÄNKUNG
Wie bei allen serologischen Tests auf Syphilis müssen die mit dem EIA-Assay Syphilis Total Ab
erhaltenen Ergebnisse in Verbindung mit den klinischen Symptomen, der Krankengeschichte und
anderen Laborwerten interpretiert werden, um zu einer klinischen Diagnose zu gelangen.
Es gibt keinen Test oder definitiven Referenzstandard, der für alle Stadien der Krankheit anwendbar
wäre. Die Diagnose von Syphilis beruht daher hauptsächlich auf serologischen Tests, wobei Befunde
von Treponema- und Nicht-Treponema-spezifischen Methoden heranzuziehen sind.
Kein diagnostischer Test bietet absolute Gewissheit, dass eine Probe nicht doch geringe Mengen an
Antikörper gegen T. pallium enthält, wie es zum Beispiel in einem sehr frühen Infektionsstadium der
Fall ist. Ein negatives Ergebnis schließt daher die Möglichkeit einer Syphilis-Infektion nicht aus.
Jedes ELISA-Verfahren kann zu falsch positiven Ergebnissen führen. Es wird empfohlen, die
Spezifität der Reaktion einer Probe, die, nach den Interpretationskriterien des Syphilis Total Ab-Kit,
mehrmals positiv war, mit einer geeigneten Methode zu überprüfen: Treponema pallidumHämagglutinationsassay.
Alle Treponema-positiven Testergebnisse bleiben nach einer Treponema-Infektion positiv und können
daher nicht zur Beurteilung des Ansprechens auf eine Therapie herangezogen werden. Aufgrund der
dauerhaften Reaktivität, die im Allgemeinen lebenslang erhalten bleibt, sind die Ergebnisse von
Treponema-Tests hinsichtlich der Feststellung eines Rezidivs oder erneuten Infektion bei einem
Patienten, für den bereits ein positives Ergebnis vorliegt, nicht von Nutzen. In einem solchen Fall
sollten andere Assays verwendet werden: Syphilis IgM EIA, RPR und TPHA.
Mit der spektrophotometrischen Methode für die Überprüfung der Proben-, Konjugat- und
Entwicklungslösungpipettierung kann die Präzision der pipettierten Menge von Probe und Konjugat
nicht kontrolliert werden. Diese Methode weist nur das Vorhandensein von Probe und Konjugat nach.
Die Fehlerquote bei dieser Methode steht in unmittelbarem Zusammenhang mit der Präzision des
verwendeten Systems (ein kumulierter Variationskoeffizient über 10 % für Pipettierung und Ablesen
von Messwerten beeinträchtigt die Qualität dieses Schrittes erheblich).
9. LEISTUNGSMERKMALE
9.1. Präzisionsmessung
Die Reproduzierbarkeit und die intermediäre Präzision wurden unter Verwendung von Proben mit
unterschiedlichen Konzentrationen an Syphils-Antikörpern bestimmt. Zur Bestimmung der
Wiederholbarkeit wurden die Proben innerhalb einer Testreihe 30 Mal getestet.
Die Proben wurden außerdem 20 Tage lang in Doppelbestimmungen getestet (jeweils 2 Tests pro
Tag).
Es wurden die Quotient-Mittelwerte, Standardabweichungen und der Variationskoeffizient (VK)
berechnet.
[DE] 9
9.1.1. Reproduzierbarkeit:
Proben
N
Mittelwert
Standardabweichung
VK%
Schwach negativ
30
0,14
0,014
9,5%
Stark negativ
30
0,68
0,051
7,5%
Schwach positiv auf
Syphilis-Ak
30
1,90
0,070
3,7%
Positiv auf Syphilis-Ak
30
3,76
0,130
3,5%
Die VK der positiven Proben liegen unter 10 %.
9.1.2. Intermediäre Präzision
Proben
Schwach
negativ
Stark
negativ
Schwach
positiv auf
Syphilis-Ak
Positiv auf
Syphilis-Ak
N
QuotientMittelwert
Intraassay
Interassay/Bediener
An versch.
Tagen
Reproduzierbarkeit
gesamt
SD
VK%
SD
VK%
SD
VK%
SD
VK%
80
0,15
0,035
22,5%
0,023
14,7%
0,017
10,9%
0,045
29,0%
80
0,74
0,038
5,1%
0,074
10,0%
0,006
0,8%
0,084
11,2%
80
2,30
0,112
4,9%
0,312
13,5%
0,099
4,3%
0,346
15,0%
80
4,13
0,180
4,3%
0,543
13,1%
0,195
4,7%
0,604
14,6%
Die VK der positiven Proben liegen bei 15 % oder darunter.
9.2. Klinische Leistungsmerkmale
Die klinischen Leistungsmerkmale des Syphilis Total Ab-Assays wurde in prospektiven und
retrospektiven Studien bestimmt:
Prospektive Studie:
- 5195 Proben von zufällig ausgewählten Blutspendern
- 460 Proben von Patienten mit Verdacht auf Syphilis.
Retrospektive Studie:
- 350 positive Proben von STD-Patienten.
Die Studien wurden in 2 Blutspendezentralen, in einem Zentrum für Geschlechtskrankheiten und bei
Bio-Rad durchgeführt.
9.2.1. Diagnostische Spezifität
Die Studie wurde mit Serum- und EDTA-Plasmaproben von zufällig ausgewählten Spendern an 2
Blutbanken in Frankreich durchgeführt.
Auch mit Patientenproben wurde eine Spezifitätsstudie durchgeführt.
Alle Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen anderer Syphilis-Tests mit CE-Zeichen verglichen.
[DE] 10
Tabelle 1: Spezifitätstest (IR = Initial Reactive (bei Ersttestung positiv); RR= Repeat Reactive (bei
Testwiederholung positiv))
Population
Blutspend
er
Patienten
Standort
1+2
3
Gesamte
Probenzahl
Initial
Reactive
(IR)
Repeat
Reactive
(RR)
RRSpezifität
(%)
Serum SST
3127
2
2*
3125/3125
Plasma EDTA K2
2068
2
2*
2066/2066
Gesamt
5195
4
4*
Serum
351
1
1
Probentyp
100%
5191/5191
99,72%
350/351
95% VI (%)
99,93% 100%
98,42 – 100
%
*Proben, die bei Testwiederholung mit einem andere Syphilis-EIA-Assay mit CE-Zeichen positiv waren
(Repeat Reactive) wurden von der Berechnung der diagnostischen Spezifität ausgeschlossen.
9.2.2. Diagnostische Sensitivität
Retrospektive Studie:
Die Studie wurde mit 350 eingefrorenen Proben durchgeführt, von denen 2 Proben in den SyphilisAssays mit CE-Zeichen negativ und 348 positiv waren.
Unter diesen 348 positiven Proben stammten 7 Proben von Patienten in einer Frühphase der
Infektion.
Alle 348 Proben erwiesen sich im Syphilis Total Ab-Assay von Bio-Rad positiv.
Prospektive Studie:
Insgesamt 460 frische Proben wurden sowohl mit dem Syphilis Total Ab-Assay und zum Vergleich
außerdem mit anderen Syphilis-Tests mit CE-Zeichen untersucht.
348 Proben erwiesen sich sowohl in dem Test von Bio-Rad als auch in den Vergleichstests als negativ
(wobei sich zwei Proben im EIA-Vergleichstest als falschpositiv erwiesen).
109 Proben waren in beiden Assays positiv.
3 Proben ergaben abweichende Ergebnisse (nach Testwiederholung mit dem Bio-Rad-Assay):
• 1 Probe war im Bio-Rad-Assay positiv und in den Vergleichstests stark negativ. Diese Probe
mit niedriger Syphilis-Rate lieferte in beiden EIA-Tests grenzwertige Ergebnisse:
• 1 Probe war in den Vergleichstests positiv und im Bio-Rad-Assay negativ (von 1 Patienten
ohne Anzeichen einer Infektion)
• 1 Probe war in den Vergleichstests positiv, mit dem Bio-Rad-Assay initial negativ und bei
Testwiederholung positiv.
Retrospektive und prospektive Studien:
Die allgemeine diagnostische Sensitivität betrug 99,56 % (457/459) mit einem Konfidenzintervall bei
95 % von [98,44 % - 99,95 %].
Klinische Sensitivität:
Die klinische Sensitivität wurde mit 3 im Handel erhältlichen Panels und 1 Serokonversionspanel
untersucht. Der Syphilis Total Ab-Assay von Bio-Rad wurde mit einem Syphilis-Assay mit CE-Zeichen
verglichen. Der Assay von Bio-Rad und der Syphilis-Vergleichsassay lieferten bei jeder Probe in den
Panels äquivalente Ergebnisse.
9.3. Analytische Sensitivität
Die analytische Sensitivität wurde mit 2 NIBSC-Standards untersucht und mittels Regression am CutOff berechnet:
1. Die Nachweisgrenze für IgG/IgM wurde mit 3 Chargen des Syphilis Total Ab-Assays
untersucht und lag bei ca. 0,53 mIE/ml mit einem KI von 95 % [0,10 mIE/ml – 1,30 mIE/ml] mit
dem WHO-Standard-IgM/IgG (NIBSC-Code: 05/132).
[DE] 11
2. Die Nachweisgrenze für IgG wurde mit 1 Charge des Syphilis Total Ab-Assays untersucht und
lag bei ca. 0,11 mIE/ml mit einem KI von 95 % [0.02 mIE/ml – 0,27 mIE/ml] mit dem WHOStandard-IgG (NIBSC-Code: 05/122).
9.4. Studie zur analytischen Spezifität/Kreuzreaktivität
Es wurden insgesamt 125 potenziell kreuzreagierende Proben mit Antikörpern gegen Pathogene, die
zu Infektionskrankheiten führen können (Lyme, Toxoplasmose, EBV, Leptospirose, Hepatitis AAntikörper, Hepatitis B-Antikörper, Hepatitis C-Antikörper, HTLV I/II und HIV), Proben von
Risikopatienten (Schwangere und Mehrgebärende) oder Proben von Patienten mit Immunstörungen
(Rheumafaktor, SLE (Lupus)) mit dem Syphilis Total Ab-Assay getestet.
Unter den 125 getesteten Proben erwies sich 1 Probe als positiv, wobei das Ergebnis im Syphilis Total
Ab-Assay wiederholbar war. Die Positivität dieser Probe bestätigte sich nach Testung mit anderen
Syphilis-EIA-Assays mit CE-Zeichen und anderen Bestätigungsassays.
Die in dieser Zielpopulation beobachtete Spezifität beträgt 100 % (124/124) mit einem 95%Konfidenzintervall von [97,1 % - 100,0 %].
9.5. Hook-Effekt
Das Vorhandensein eines möglichen Hook-Effekts wurde durch Testung von 6 Syphilis-positiven
Proben mit hohen Titern in verschiedenen Verdünnungen untersucht. Die Äquivalenz der Ergebnisse
zwischen unverdünnten und verdünnten Proben zeigt das Nichtvorliegen eines Hook-Effekts bei den
getesteten Proben.
10. LITERATUR
1. Levinson SS. The Nature of Heterophilic Antibodies and Their Role in Immunoassay Interference.
J. Clin. Immunoassay 15: 108-115,1992.
2. Norris S.J. Plypeptides of Treponema pallidum: Progress toward understanding their structural,
functional and immunological role. Microbiological Reviews, Setpt. 1993 Vol 57.
3. Larsen SA, Steiner BM, and Rudolph AH. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for
syphilis. Clin Microbiol Rev. 1995 Jan; 8(1):1–21.
4. Zrein M, Maure I, Boursier F, Soufflet L. Recombinant antigen-based enzyme immunoassay for
screening of Treponema pallidum antibodies in blood bank routine. J Clin Microbol. 1995 Mar;
33(3):525–7.
5. Singh AE and Romanowski. Syphilis: Review with emphasis on clinical, epidemiological, and
some biologic features. Clin Microbiol Rev. 1999 Apr; 12(2):187–209.
6. Stability of selected serum proteins after long-term storage in the Janus Serum Bank. Clin Chem
Lab Med. 2009. 47:596-606.
7. International Journal of STD & AIDS 2009; 20: 300–309.
8. Screening donated Blood for Transfusion-Transmissible infections. World Health Organization.
2009
9. M. J. Loeffelholz, and M. J. Binnicker, ‘It Is Time to Use Treponema-Specific Antibody Screening
Tests for Diagnosis of Syphilis’, J Clin Microbiol, 50 (2012), 2-6.
[DE] 12
[DE] 13
[DE] 14
[DE] 15
[DE] 16
Bio-Rad
3, Boulevard Raymond Poincaré
92430 Marnes-la-Coquette, Frankreich
Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00
Fax: +33 (0) 1 47 41 91 33
www.bio-rad.com
2014/11
883679
[DE] 17