BIOCHEMIE des Stoffwechsels (772.113)

Inhaltsverzeichnis Glycolyse
BIOCHEMIE des Stoffwechsels
(772.113)
1. Glucosetransport
2. Abfolge der chemischen Umwandlungen der
Glucose in Pyruvat (10 Reaktionen)
3. Mechanismen der einzelnen Reaktionen
4. Thermodynamik und Regulation
6. Einheit
Schicksale des Pyruvats
5. Einschleusen von Galactose, Mannose,
Fructose und Glycerin in die Glykolyse
6. Schicksale des Pyruvats
GLUCOSE
2 NAD+
2 ADP + 2 Pi
Neben der aeroben Option (Citratzyklus und Atmungskette) gibt
es mehrere anaerobe Optionen, z.B.:
Fructose-1,6-bisphosphat
2 ATP
2 NADH
2 Pyruvat
Anaerobe
homolactische
Fermentation
Aerobe Oxidation
(Mitochondrien)
Das in der Glycolyse gebildete Pyruvat muss weiter umgesetzt
werden, damit die Glycolyse weiterlaufen kann. Wichtig ist, dass
das bei der Oxidation des Glycerinaldehyd-3-phosphats reduzierte
NAD+ regeneriert wird.
Anaerobe
alkoholische Gärung
Hefen und einige andere Organismen bilden bei anaerobem
Zuckerabbau Ethanol und CO2 anstelle von Lactat (alkoholische
Fermentation). Im Gegensatz zu fakultativen Anaerobiern wie E.
coli, die für eine unbegrenzte Zeit anaerob wachsen können, können
Hefen nur einige Generationen lang in völliger Abwesenheit von
Sauerstoff existieren, da sie molekularen Sauerstoff für die Synthese
von Membrankomponenten benötigen.
Heterolactische Bakterien produzieren neben Lactat auch Ethanol.
Andere Bakterien (Propionsäure-Bakterien) wiederum wandeln
Pyruvat reduktiv in Propionat um (Herstellung des Schweizer Käse).
Andere fermentative Produkte sind beispielsweise Butyrat (ranzige
Butter), Aceton oder Isopropanol.
In allen Fällen wird NADH durch Transfer von Elektronen auf einen
organischen Akzeptor reoxidiert (= Definition der Fermentation).
Reduktion von Pyruvat zu Lactat durch Lactat-Dehydrogenase.
Viele Organismen haben sich dafür entschieden. Selbst der humane
Skelettmuskel bedient sich dieser Strategie, wenn die
Sauerstoffversorgung nicht mehr ausreicht.
Ökonomisch ist die homolactische Fermentation sehr bedeutend,
(z.B. Rolle von Bakterien in der Käse- und Joghurtherstellung
mittels Fermentation von Lactose der Milch).
1. Homolactische Fermentation
2. Alkoholische Fermentation
3. Aerobe Oxidation
Homolactische Fermentation
Ein häufiger Mechanismus der anaeroben Reoxidation von
NADH mittels Pyruvat ist die Reduktion der Carbonyl-Gruppe
des Pyruvats. Die Lactatbildung aus Pyruvat ist thermodynamisch
begünstigt, sodass (selbst unter aeroben Bedingungen) Lactat
akkumuliert.
HPO42-
Glycolyse 11. Reaktion: Lactat-Dehydrogenase
O
COPO32-
CHO
H
C
H
OH
C
1,3BPG
OH
CH2OPO32-
CH2OPO32-
Pyruvat + NADH + H+  L-Lactat + NAD+
Enzym:
Oxidoreductase
Lactat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.28)
Glycerinaldehyd3-phosphat
Tetramer: 4  35 kDa (Kaninchenmuskel)
NAD+
NADH + H+
Cofaktor:
NADH
L-Lactat
Pyruvat
O
Lactat
O
OH
H3C
C
COO
H3C
-
LactatDehydrogenase
H
C
COO-
OH
Pyruvat
2C
3 CH3
5
O
4
Übertragung des pro-R-Wasserstoffs (A-Seite) am C(4)-des NADH
auf die re-Seite des C(2) des Pyruvats unter Bildung von L(oder S-)Lactat.
C
3
NH2
H+
6 1 2
N
Pyruvat
Vergleich mit Glycerinaldehyd-3-P-Dehydrogenase, GAP-DH, zeigt,
dass bei GAP-DH die Hydridübertragung auf die andere Seite (BSeite) des Nicotinamid-Ringes
erfolgt!
NADH
R
O
O
H
C
2
3 CH3
L-Lactat
O
C
1C
OH
H
C
Lactat-Dehydrogenase, LDH, arbeitet absolut stereospezifisch:
HS
HR
O
1C
2
3 CH3
O
O
O
1C
NH2
H
N
R
Überlagerung von Proteingebundenem NAD+ in LDH
und GAP-DH zeigt
Verdrehung des jeweiligen
Nicotinamid-Ringes
um 180°
NAD+
in GAPDH
NAD+
in LDH
NAD+
Monomer
Rossmann – Falte: Typisches Faltungsmotiv in NAD+ –bindenden
Dehydrogenasen. Besteht aus zwei strukturell ähnlichen Domänen:
(a) Nicotinamid-bindende Domäne (gelb) und
(b) Adeninbindende Domäne (rot)
Ausrichtung des
Pyruvats durch
Arg171 und His195
LactatDehydrogenase
R
N
H
H2 N
C
H
C
O
CH2
CH 3
O
H
N
Lactat-Dehydrogenase
His195
(Monomer)
NH
C
O
O
H 2N
NAD+
NH 2
C
Hydridübertragung vom
C(4) des NADH auf C(2)
des Pyruvats
NH 2
Arg171
H+
NAD +
O
O
Gleichzeitige Übertragung
eines Protons von der
Imidazolium-Einheit des
His-195
Pyruvat
C
H
C
OH
CH 3
Pyruvat + NADH + H+  L-Lactat + NAD+
G‘ = -25,2 kJ/mol; Keq(25°C) = 2,63  104
G‘ = -14,8 kJ/mol
Säugetiere: 2 Arten von Untereinheiten: M und H (Aminosäuresequenzen stimmen zu 75% überein; Nachweis in SDS-PAGE)
Fünf tetramere Isoenzyme (Hybridformen):
M4, M3H, M2H2, MH3, H4 (M und H werden durch unterschiedliche
Gene codiert, die durch Genduplikation entstanden sind).
Aerobes Gewebe (Herzmuskel): Überwiegend Expression der
H-Form (H4, MH3); Hemmung dieser Isoformen durch Pyruvat um
Verschwendung dieser potentiell sehr energiereichen
Kohlenstoffquelle zu verhindern. Im aeroben Gewebe soll Pyruvat in
den Citrat-Zyklus eingeschleust werden! Diese Isoformen haben
zudem einen geringen KM-Wert für Lactat. Vorhandenes Lactat wird
bevorzugt zu Pyruvat oxidiert.
Anaerobes Gewebe (Skelettmuskel, Leber): Das aktive
Muskelgewebe ist anaerob und ist auf die Glycolyse als ATPProduzent angewiesen! Es bildet eine erhebliche Menge an Pyruvat
(und Alanin, siehe unten). Hier darf die Lactat-Dehydrogenase durch
Pyruvat nicht gehemmt werden, da sich sonst der Vorrat an NAD+
vermindern würde und der glycolytische Reaktionsweg wäre
unterbrochen! Tatsächlich hat das aktive Muskelgewebe erhöhte
Pyruvat-Spiegel und wandelt Pyruvat bereitwillig in Lactat um.
Im anaeroben Gewebe überwiegt die M-Form (M4, M3H); diese
Isoformen arbeiten optimal unter anaeroben Bedingungen und
werden durch Pyruvat nicht gehemmt. Der KM-Wert für Lactat ist
hoch. Pyruvat wird bevorzugt zu Lactat reduziert, das freigesetzt
wird.
2 Typen von Skelettmuskeln:
A. TYP 1 (LANGSAME FASERN): Aerobes Gewebe. Langsam,
stetig sich kontrahierende Muskeln (Beispiel: Herzmuskel); enthält
viele Mitochondrien („rote Mukselfasern“ siehe Aufbau der
Elektronentransportkette und Vorkommen von Cytochromen) und
viel Myoglobin (Sauerstoffspeicher). Aerobes Gewebe produziert
ATP über oxidative Phosphorylierung. Die Stärke dieser
Muskelfasern sind oftmalige Kontraktionen mit jeweils geringer
Kraftentwicklung und mit möglichst vollständiger aerober
Energiebereitstellung und somit geringer Ermüdung.
B. TYP 2 (SCHNELLE FASERN): Anaerobes Gewebe. Beispiel:
Skelettmuskeln für kurzzeitige schnelle Leistung (kräftige,
schnelle Kontraktion). wenige Mitochondrien („weiße Muskelfasern“) und Myoglobin. ATP wird hauptsächlich über die
Glycolyse mit anschließender Lactatbildung erzeugt.
Anaerobe Glykolyse: ATP-Produktion 100mal schneller als bei
oxidativer Phosphorylierung.
Muskelkater (Muskelermüdung, Muskelschmerz) ist KEINE Lactatanhäufung, sondern Akkumulation der durch Glycolyse erzeugten
Säure:
Glucose + 2 ADP + 2 Pi  2 Lactat + 2 ATP + 2 H+
Muskeln können ihre Arbeitsleistung auch bei hoher Lactatkonzentration aufrechterhalten, wenn der pH-Wert konstant gehalten
wird ( das Fleisch eines gehetzten Tieres schmeckt durch LactatAkkumulierung in den Muskeln sauer).
Bilanz der Reaktionsfolge Glucose  Lactat:
Glucose + 2 ADP + 2 Pi  2 Lactat + 2 ATP + 2 H+
vgl. Oxidative Phosphorylierung: 38 ATP/Glucose
(bei Annahme 3 ATP pro NADH)
Pasteur: „Hefe benötigt bei anaerobem Wachstum wesentlich mehr
Zucker als bei aerobem Wachstum“ (Pasteureffekt).
Blut
Leber
Glucose
Muskel
Glycogen
Glucose
ATP + GDP+ Pi
ADP + Pi
GLYCOGENOLYSE
GLYCOLYSE
GLUCONEOGENESE
ATP, GTP
ATP
Lactat
Lactat
CORI-ZYKLUS
Die Lactatbildung ist im Stoffwechsel ein totes Gleis. Das Lactat
muss in Pyruvat zurückverwandelt werden, bevor es metabolisiert
werden kann. Es ist zu beachten, dass die Umwandlung von Glucose
in Lactat keine Netto-Oxidations-Reduktions-Reaktion darstellt. Die
Lactat-Bildung bringt Zeitgewinn und verlagert einen Teil des
Stoffwechsels von der Muskulatur zur Leber.
Wie? Die Plasmamembran der meisten Zellen ist für Lactat und
Pyruvat hochpermeabel. Beide Substanzen diffundieren aus dem
aktiven Skelettmuskel in das Blut und werden zur Leber transportiert.
Im Muskel wird aufgrund des hohen NADH/NAD+-Verhältnisses
aus Pyruvat Lactat gebildet, das ins Blut abgegeben wird. In der
Leber jedoch ist das NADH/NAD+-Verhältnis im Cytosol niedrig und
somit die Lactat-Oxidation zu Pyruvat begünstigt. Das gebildete
Pyruvat wird in der Leber in der sog. Gluconeogenese zu Glucose
umgewandelt, die über das Blut wieder zur Skelettmuskulatur
gelangen kann (Cori-Zyklus).
Bei der Muskelkontraktion und in Erythrocyten entstehen aus
Pyruvat neben Lactat auch Alanin durch Transaminierung.
Wiederum läuft in der Leber die umgekehrte Reaktion ab. Neben
Lactat ist Alanin das wichtigste Rohmaterial für die
Gluconeogenese.
Alanin-Aminotransferase, die in Säugetiergeweben reichlich
vorkommt, katalysiert die Übertragung der Aminogruppe des
Alanins auf -Ketoglutarat:
Alanin + -Ketoglutarat  Pyruvat + Glutamat
In der Leber, wo in Säugetieren hauptsächlich der AminosäureAbbau stattfindet, wird Alanin in Pyruvat umgewandelt, das dann
in der Gluconeogenese verwendet werden kann.
HPO42-
1. Homolactische Fermentation
O
CHO
H
2. Alkoholische Fermentation
C
H
OH
COPO32C
OH
1,3-BPG
CH2OPO32-
CH2OPO32-
Glycerinaldehyd3-phosphat
Alkoholische Gärung
In Hefe wird NAD+ unter anaeroben Bedingungen durch die
Umwandlung von Pyruvat in Ethanol und CO2 regeneriert (
Herstellung alkoholischer Getränke bzw. Aufgehen des
Hefeteigs). Ethanol und CO2 werden in Hefezellen durch zwei
Reaktionen erzeugt.
NAD+
NADH + H+
H3C
O
Pyruvat
C
COO-
O
PyruvatDecarboxylase
C
H
CO2
Ethanol
H3C
OH
C
H
H
AlkoholDehydrogenase
H3C
Acetaldehyd
Hefe
Pyruvat-Decarboxylase
Pyruvat  Acetaldehyd + CO2
Enzym:
CO2
O
H3 C
Lyase
O
O
C
C
H3 C
O-
C
H
Pyruvat-Decarboxylase (EC 4.1.1.1.)
Hefe
Cofaktor:
Decarboxylierung von Pyruvat unter Bildung von Acetaldehyd
und CO2.
Thiaminpyrophosphat
Pyruvat
Acetaldehyd
Enzym:
Pyruvat-Decarboxylase (kommt bei Tieren und
Menschen nicht vor!).
Coenzym:
Thiaminpyrophosphat (TPP). Häufigstes
Coenzym bei -KetocarbonsäureDecarboxylierungen
Thiaminpyrophosphat
H3C
PyrimidinDerivat
NH2
H2
4 5
3
C N 2 1S
C
N
H3C
H2
C C O
H2
Thiaminpyrophosphat
O
O
O-
P
saures Proton
O-
O-
1
5
2
saures Proton
H
N
O
P
Der Thiazoliumring bildet die katalytisch aktive funktionelle
Gruppe der Pyruvat-Decarboxylase. Im Menschen findet man
dieses Coenzym u.a. in der Pyruvat-Dehydrogenase oder in der
-Ketoglutarat-Dehydrogenase.
3
Dipolares Carbanion (YLID):
4
aktive Form des Coenzyms
(Funktion als Elektronensenke)
Stabilisierung durch pos. geladenes quarternäres Stickstoffatom
O
O
-
O
C
H3C
O
R'
H3C
R'
O
C
C
R
O
R
N
+
H
S
R
C
C
S
C
O
R
Bei der Decarboxylierung einer -Ketocarbonsäure würde im
Übergangszustand eine negative Ladung am verbleibenden
Carbonylkohlenstoff entstehen, was aber einem sehr instabilen
Zustand entsprechen würde. Der Übergangszustand kann aber
durch Delokalisierung der negativen Ladung innerhalb einer
Elektronensenke (=TPP) stabilisiert werden.
N
O
H3 C
C
C
O-
H3C
C
C
O-
OH
O
Nucleophiler Angriff der Ylidform des TPP am Carbonylkohlenstoff
des Pyruvats und in der Folge Austritt des CO2 unter Bildung eines
resonanzstabilisierten Carbanions.
H3C
R'
N
R
H3C
CO2
S
N
R
C
S
C
C
O
H3C
-
OH
C
H 3C
Protonierung
des
Carbanions
C
OH
Resonanzstabilisiertes Carbanion
R'
N
H 3C
Resonanzstabilisiertes
Carbanion
S
C
R
H3C
S
C
Hydroxyethyl-TPP
R
N
R
H+
R'
OH
OH
H3C
S
C
H3C
C
H3C
R'
N
R
C
O
H3C
H3C
R'
R'
N
H 3C
OH
C
H
OH
Pyruvat-Decarboxylase
aus Hefe
C
+ H+
H
S
C
C
O
H 3C
Hefe, Mensch
Eliminierung
des TPP-Ylids und
Produktfreisetzung
H3C
R
R'
N
S
TPP (Ylid)
C
Alkohol-Dehydrogenase
Acetaldehyd + NADH + H+  Ethanol + NAD+
TPP
Enzym:
Oxidoreductase
Alkohol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.1.)
Hefe (Tetramer), Mensch: Leber (Dimer)
Cofaktoren:
NADH , Zn2+
Acetaldehyd
Ethanol
TPP
O
H3C
NADH
NAD+
H3C
C
H Alkohol-
Dehydrogenase
Humaner Stoffwechsel: Primäre Alkohole, insbesondere Ethanol,
werden in zwei Schritten in der Leber metabolisiert:
OH
C
H
Alkohol-Dehydrogenase (ADH):
H
Ethanol + NAD+  Acetaldehyd + NADH + H+
Aldehyd-Dehydrogenase (ALDH):
Hefe:
ADH ( “yeast“-ADH, YADH): Tetramer
Acetaldehyd + NAD+  Acetat + NADH + H+
Mensch:
Leber-ADH.
Thiokinase:
Alkohol-Quelle:
a) zugeführt („Nahrung“)
b) von Darmflora (anaerob) produziert
Acetat + CoA + ATP  Acetyl-CoA + AMP + PPi
Dimer: Hohe Homologie zwischen YADH und
humaner ADH, Zn2+-abhängige Reaktion
Alkohol und Aldehyd, jedoch nicht das Acetat sind giftig. Letzteres
kann z.B. als Acetyl-CoA im Citrat-Cyclus verwertet werden.
Die Alkohol-Dehydrogenase ist ein Zink-Protein, während die
Aldehyd-Dehydrogenase ein Molybdän-Eisen-Flavoprotein ist.
Katalytisches
Zink von
außen nicht
sichtbar
Das katalytische
Zink-Ion sitzt in
einer etwa 20 Å
tiefen Tasche in der
Verbindungsstelle
von zwei Domänen.
In dieser Tasche
befinden sich auch
Substrat und
CoenzymBindungsstellen.
grün:
NAD+
CH3
H
S
C
H
O
Zn
S
N
Das elektropositive Zink-Ion, Zn2+,
fördert die Deprotonierung des Substrats
unter Bildung von koordiniertem RO-,
Ethanolat. Funktion des Zink-Ions als
Lewis-Säure (= Elektronenmangelverbindung)
Zink ist für die Bindung des
Alkohols nötig, nicht jedoch für
die Bindung des Coenzyms
NAD+, das an der anderen
Domäne bindet. Die redoxaktive
Position des Nicotinamid-Rings
des Cofaktors NAD+ ist mit
einem Pfeil gekennzeichnet.
His
Cys
Zn2+
Cys
CH3
H
C
H
S
O
Zn
S
N
Schematische
Darstellung des
NAD+-bindenden
Bereichs in der ADH
der Leber.
Die Bindung des Coenzyms NAD+ an ADH
ist mit einer Konformationsänderung des
Proteins von einer offenen zu einer
geschlossenen Form verbunden (induced fit:
Drehung der beiden Domänen um etwa 10°).
Das Coenzym wird dadurch für die HydridIonen-Übertragung vom -Kohlenstoffatom
des Alkohols auf den Nicotinamidring richtig
positioniert. Nach der Elektronenübertragung
dissoziieren Produkt und NADH rasch ab.
Humane ADHs oxidieren verschiedenartige kurzkettige primäre und
auch sekundäre aliphatische Alkohole (mit sehr unterschiedlichen
Reaktionsgeschwindigkeiten). Es gibt verschiedene ADH-Isoformen
unterschiedlicher Reaktivität.
Hydrid-Übertragung vom
zinkgebunden Ethanolat-Ion
auf NAD+ unter Bildung von
Acetaldehyd und NADH
Methanol wird auch (relativ langsam) umgesetzt und damit zu
toxischem(!) Formaldehyd oxidiert. Bei Methanol-Vergiftungen
versucht man diese Reaktion durch Ethanolgaben zu unterdrücken!
Andere Alkohole wie n-Propanol oder n-Butanol werden zwar rasch
zum entsprechenden Aldehyd oxidiert, jedoch nur langsam
weiteroxidiert ( unangehme physiologische Nebenreaktionen).
Bei der Ethanol-Oxidation entstehender Acetaldehyd ruft “Kater”ähnliche Syndrome hervor. Das für die Oxidation verantwortliche
Enzym Aldehyd-Dehydrogenase kann - genetisch bedingt – ineffizient
arbeiten (häufig bei Ostasiaten) Ansteigen des Acetaldehyd-Spiegels.
Alkoholtherapie: Durch Verabreichung des Schwermetallkomplexierenden Tetraethylthiuramdisulfids (Disulfiram, “Antabus”)
wird das Metalloenzym Aldehyd-Oxidase inaktiviert. Hohe AldehydKonzentrationen werden dabei also bewußt zur Erzeugung von
unangenehmen Nebenwirkungen eingesetzt.
Unterschiedliche ADH-Verfügbarkeit wird dafür verantwortlich
gemacht, dass Ethanol an Missbildungen und Krebsentstehung
beteiligt sein kann. Frauen verfügen z.B. im Gastro-Intestinalbereich
über weniger ADH, sodass bei gleichem Alkoholkonsum mehr in die
Blutbahn und in das zentrale Nervensystem gelangen kann.
Warum schädigt Alkohol die Leber? Sowohl ADH als auch ALDH
produzieren in der Leber NADH, das akkumuliert und die Oxidation
von Lactat zu Pyruvat (und somit die Gluconeogenese) hemmt.
Folge Hypoglykämie und Lactatacidose! Der Überschuss an NADH
hemmt auch die Fettsäureoxidation. Folge: Fettleber.
1. Homolactische Fermentation
2. Alkoholische Fermentation
3. Aerobe Oxidation
Aerobe Oxidation
Im Zuge der aeroben Oxidation werden Reduktionsäquivalente
(NADH, FADH2) letztendlich in der Atmungskette der
Mitochondrien oxidiert. Neben dem in der Glycolyse anfallenden
NADH, entstehen weitere Reduktionsäquivalente im CitronensäureCyclus. Die Pyruvat-Dehydrogenase verbindet die Stoffwechselwege der Glycolyse und des Citronensäure-Cyclus. Acetylgruppen
treten als Acetyl-CoA, das gemeinsame Produkt des Kohlenhydrat-,
Fettsäure- und Aminosäureabbaus, in den Citronensäure-Cyclus ein.
Im Kohlenhydrat-Stoffwechsel katalysiert die PyruvatDehydrogenase die Umwandlung von Pyruvat in Acetyl-CoA.
Glucose
Glycolyse Aerobe Option: Oxidation von NADH in der
Atmungskette der Mitochondrien.
In diesem Fall unterliegt das Pyruvat der
enzymatischen Decarboxylierung unter
Bildung von Acetyl-CoA, das in den sog.
Citronensäure-Cyclus (TricarbonsäureCyclus; TCA-Cyclus; Krebs-Cyclus)
eingeschleust wird. Dort wird Acetyl-CoA
oxidativ formal zu CO2 abgebaut.
Pyruvat
Acetyl-CoA
Pyruvat
- DH
TCACyclus
Acetyl-CoA
Elektronentransport
Oxidative
Phosphorylierung
Der TCA-Zyklus ist verantwortlich für den
größten Teil der Kohlenhydrat-, Fettsäureund Aminosäureoxidation. Neben seiner
herausragenden Rolle im katabolen
Stoffwechsel, stellt der Citronensäurezyklus
aber auch zahlreiche Zwischenstufen für
Biosynthesen zur Verfügung (amphibolische
Natur des Citronensäure-Cyclus).
Äußere
Membran
Cristae
TCACyclus
Matrix
Im Citronensäure-Cyclus werden die (u.a. durch PyruvatDehydrogenase) gebildeten Acetyl-CoA-Einheiten formal zu CO2
oxidiert. Nettoreaktion:
3 NAD+ + FAD + GDP + Acetyl-CoA + Pi + 2 H2O 
3 NADH + FADH2 + GTP + CoA + 2 CO2 + 2 H+
Die gebildeten Reduktionsäquivalente werden anschließend in der
Atmungskette mittels molekularem Sauerstoff reoxidiert..
Innere
Membran
Matrix
Intermembranraum
Mitochondriale Matrix: enthält (u.a.) Enzyme des CitronensäureCyclus sowie den Multienzymkomplex Pyruvat-Dehydrogenase
(Rinderherz: 8400 kDa), der aus Pyruvat Acetyl-CoA synthetisiert.
Wie gelangt das Endprodukt der Glycolyse, Pyruvat, in die
mitochondriale Matrix?
•
Es gibt mehrere mitochondriale Transportsysteme für Ionen und
geladene Metaboliten:
Der Pyruvat-Carrier befördert entweder im Austausch
gegen OH- (Pyruvat/OH--Antiport) oder zusammen mit
H+ (Pyruvat/H+-Symport) Pyruvat vom Cytosol in die
Mitochondrien.
•
Der Eintritt von ADP in die Mitochondrien ist mit dem
Austritt von ATP über eine sog. ATP-ADP-Translocase
gekoppelt
•
Der Phosphat-Carrier arbeit in Abstimmung mit der ATPADP-Translocase und vermittelt den elektroneutralen
Austausch von Pi und OH-.
•
Der Dicarboxylat-Carrier befördert Malat, Fumarat und
Succinat im Austausch gegen Pi aus dem Mitochondrium.
Innere
Membran
•
Der Tricarboxylat-Carrier befördert Citrat und ein Proton im
Austausch gegen Malat.
Cytosol
Diesen mitochondrialen Carriern liegt ein gemeinsames
Strukturmotiv zugrunde. Sie bestehen aus drei ähnlichen, jeweils
etwa hundert Reste umfassenden Einheiten mit jeweils 2
Transmembran-Helices:
Matrix
1
2
3
4
5
6
COO-
NH3+
Pyruvat-Dehydrogenase
Pyruvat + CoA + NAD+  Acetyl-CoA + CO2 + NADH
Enzym:
E.C 1.2.4.1 (Oxidoreductase)
Cofaktoren:
TPP, CoA, FAD, NAD+ und
Liponamid
Pyruvat-Dehydrogenase
Multienzymkomplex (Rinderherz: 8400 kDa):
Pyruvat-Dehydrogenase (E1):
30 E1-22-Tetramere
Dihydrolipoyl-Transacetylase (E2):
60 E2-Monomere
(Kern des Komplexes)
Dihydrolipoyl-Dehydrogenase (E3): 6 E3-Dimere
Multienzymkomplexe: hohe katalytische Effizienz durch
geringere Distanzen für Edukte und Intermediate, weniger
Nebenreaktionen und besser koordinierte Kontrolle.
Modell der PyruvatDehydrogenase:
DihydrolipoylTransacetylase (E2)Kern
PyruvatDehydrogenase
(E1, gelb)
DihydrolipoylDehydrogenase (E3)
A
B
Elektronenmikroskopische Aufnahme des Pyruvat-DH-Komplexes aus
E. coli (A) und des Dihydrolipoyl-Transacetylase (E2)-“Kerns“ (B).
Pyruvat-Dehydrogenase ist eines der kompliziertesten Enzyme, da
es zahlreiche Cofaktoren benötigt, die aus vitaminischen Vorstufen
synthetisiert werden. Die Vitamine werden aus der Nahrung
aufgenommen. Vitamine B sind wasserlöslich! Vitamine in rot sind
für die Funktionalität der Pyruvat-DH essentiell:
Coenzyme und prosthetische Gruppen der Pyruvat-Dehydrogenase
Cofaktor
Einordnung
Funktion
Thiaminpyrophosphat, TPP An E1 gebunden
Pyruvatdecarboxylierung
Liponsäure
kovalent an E2
gebunden
Übernimmt
HydroxyethylCarbanion von
TPP
Substrat für E2
Übernimmt die
Acetylgruppe
vom Liponamid
Coenzym A (CoA)
Flavinadenindinucleotid
An E3 gebunden
NAD+
Substrat für E3
Wird durch
Liponamid
reduziert
Durch FADH2
reduziert
Thiaminpyrophosphat
saures Proton
1
5
2
3
Dipolares Carbanion (YLID):
4
aktive Form des Coenzyms
(Funktion als Elektronensenke)
Stabilisierung durch pos. geladenes quarternäres Stickstoffatom
Wie wird Thiamin in Thiaminpyrophosphat im menschlichen
Körper umgewandelt?
Vitamin
Cofaktor
Thiamin (Vitamin B1)
Thiaminpyrophosphat
Riboflavin (Vitamin B2)
FAD
Niacin (Vitamin B3)
NAD+
Pantothenat (Vitamin B5)
Coenzym A
Pyridoxin (Vitamin B6)
Pyridoxalphosphat (siehe
Glykogen- und
Aminosäurestoffwechsel)
Vitamin B12
Cobalamin
(Fettsäurestoffwechsel)
Thiaminpyrophosphat ist an vielen Decarboxylierungsreaktionen als
Cofaktor beteiligt. Es leitet sich vom Thiamin ab, das als Vitamin B1,
das vom Menschen weder synthetisiert noch in ausreichender Menge
gespeichert werden kann, mit der Nahrung aufgenommen werden
muss.
Ein Mangel führt beim Menschen zu einer lebensgefährlichen
Erkrankung, der Beriberi, bei der es zu neurologischen Ausfällen
kommt (das Nervensystem verlässt sich im Wesentlichen auf Glucose
als Brennstoff!; d.h. sein Energiestoffwechsel kommt zum Erliegen):
Schmerzen, Lähmungen, Atrophie (Muskelschwund) der Extremitäten,
Ödeme (Flüssigkeitsansammlungen in Geweben und Körperhöhlen).
Beriberi tritt typischerweise in Ländern des Orients auf, in denen Reis
Hauptnahrungsmittel ist. Der Reis wird poliert, wobei seine groben,
aber thiaminhaltigen Schichten entfernt werden.
H
H
O
C
C
O
S
CH2 CH2 NH
C
CH2 CH2 NH
H
Thiamin wird in der Leber in die Pyrophosphatform übergeführt
und in der Niere dephosphoryliert (Ausscheidung).
Im Mitochondrium der Leber erfolgt die Umwandlung von
Thiamin zu Thiaminpyrophosphat (TPP) durch die
Thiamin-Kinase:
Thiamin + ATP  TPP +AMP
Neben seiner Funktion als Cofaktor in
Decarboxylierungsreaktionen (Pyruvat-Dehydrogenase,
-Ketoglutarat-Dehydrogenase), fungiert TPP als Überträger von
C2-Einheiten in Transketolasen (siehe Pentosephosphat-Cyclus).
Acetyl-CoA
Acetyl-CoA + H2O  CoA + Acetat
G’ = -31,5 kJ/mol
Die Bildung der Thioesterbindung
konserviert die Freie Enthalpie
des Pyruvats in der Pyruvat-DH-Reaktion.
O
OH
CH3
C
CH
C
CH2 O
CH3
ADP
Acetylgruppe
Pantothensäure
kann vom
Menschen nicht
synthetisiert
werden.
Cysteamin
Adenosin-3’phosphat
Wie wird Pantothenat in Coenzym A im menschlichen Körper
umgewandelt?
C C
C
H2
H
CH3
HO
Pantothenat
ist das
wasserlösliche
Vitamin B5!
Mangelerkrankungen
sind sehr
selten.
Pantothensäure-Rest
Pantothenat
CH3 OH O
C
ATP
Pantothenat-Kinase
ADP
CH3 OH O
O
O
P
C C
C
H2
H
CH3
O
O
C
4’-Phosphopantothenat
O
O
P
O
CH3 OH O
O
C C
C
H2
H
CH3
O
C
ATP + Cystein
P
Phosphopantothenoylcystein
-Synthase
O
ADP + Pi
O
P
O
O
P
C C
C
H2
H
CH3
C
O
N
H
C CH2 C
H2
NH
CH
CH2
Adenosin
P
O
O
P
O
O
C C
C
H2
H
CH3
C
N
H
C CH2 C
H2
NH
P
C C
C
H2
H
CH3
C
CH2
SH
H
O
N
H
C CH2 C
H2
O
CH
P
CH3 OH O
O
C C
C
H2
H
CH3
O
C
NH
CH
CH2
SH
O
N
H
C CH2 C
H2
H2C
CH2
CH2
S
SH
O
CH
H2C
C C CH2 C
H2 H2
ATP
DephosphoCoA-Kinase
CH
CO2
O
O
H
O
NH
PPi
SH
S
CH3 OH O
C CH2 C
H2
Dephospho-CoAPyrophosphorylase
O
O
COO-
O
N
H
ATP
COO-
Adenosin
O
C
CH3 OH O
O
O
CH3 OH O
C C
C
H2
H
CH3
Phosphopantothenoylcystein-Decarboxylase
O
O
CH3 OH O
O
O
C CH2 COOH2
N
H
C CH2 COOH2
N
H
Acetyl-Coenzym A (Acetyl-CoA)
O
C CH2 COOH2
N
H
NH
NH
(CH2)4 CH
C
O
Liponamid
2 H+ + 2 e-
ADP
HS
H2C
HS
CH
CH2
H2C
O
C C CH2 C
H2 H2
NH
NH
Phosphorylierung
Dihydroliponamid
(CH2)4 CH
C
O
H
NH
CH
CH2
SH
Liponsäure
kovalent über
Amidbindung
an Lysin im
aktiven
Zentrum des
Enzyms
gebunden
Liponsäure
(6,8-Dithiooctansäure) ist kein
Vitamin, kann
vom Menschen
endogen
synthetisiert
werden
Flavinadenindinukleotid (FAD)
NH2
N
O
D-Ribitol
CH2 O
P
H
C
OH
O
H
C
OH
H
C
OH
O
O
P
N
O
CH2
O
H
H
OH
N
Adenosin
-diphosphat
N
O
H
H
OH
Der Mensch kann die Isoalloxazin-Komponente der Flavine nicht
synthetisieren. Muss in Form des Vitamins B2 (Riboflavin)
aufgenommen werden.
CH2
H3C
H3C
N
N
5
12
4 3N
N
D-Ribitol
CH2OH
O
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
(stammt vom
Alkohol des
Zuckers DRibose)
Riboflavin
(Der Ausdruck
CH2
Isoalloxazinring
H
H3C
N
H3C
N
N
“Flavin” ist
synonym mit
dem Isoalloxazinring)
O
O
Isoalloxazin
N
H
O
O
Wie entstehen die Cofaktoren FMN und FAD aus dem Vitamin
Riboflavin?
O
CH2 OH
H
C
CH2 O
OH
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
ATP
CH2
H3C
N
N
N
H3C
ADP
O
N
H
O
N
H3C
C
OH
O
H
C
OH
H
C
OH
O
H3C
O
ATP
PPi
N
N
O
H3C
N
H
Flavinmononucleotid,
FMN
CH2 O
P
OH
O
C
H
C
OH
H
C
OH
O
N
P
Riboflavinmononucleotid,
FMN
H3C
N
H3C
N
O
CH2
O
H
H
CH2
O
Riboflavin
O
H
H
N
N
O
O
O
N
NH2
FAD-Pyrophosphorylase
N
N
O
P
H
CH2
CH2
H3C
Flavokinase
P
CH2 O
O
N
OH
N
N
O
H
H
OH
Flavinadenindinucleotid, FAD
N
H
O
Struktur von Nicotinamidadenindinucleotid (NAD+)
H
O
C
NH2
Nicotinamid
(ein Pyridinderivat)
Nicotinamid (synonym Niacinamid)
oder das Carbonsäure-Analogon
Nicotinsäure (Niacin) sind
Vitaminvorstufen (Vitamin B3) für
das Coenzym NAD+ oder NADP+.
N
O
O
O
H
H
OH
H
OH
P
O
N
O
N
N
N
O
O
P
O
O
H
H
H
OH
H
OH
C
NH2
D-Ribose
NH2
O
O
C
H
N
Adenosindiphosphat
NAD
Nicotinamid
(Niacinamid)
OH
N
Nicotinsäure
(Niacin)
Der Mensch kann Nicotinamid auch aus dem TryptophanAbbauprodukt Chinolinat synthetisieren. Bei Mangelernährung ist
dieser Weg aber nicht aktiv, weil Tryptophan in der
Proteinbiosynthese benötigt wird.
Wie entstehen die Cofaktoren NAD+ und NADP+ aus den
Vitaminen Niacin bzw. Niacinamid?
O
O
C
Nicotinat
(Niacin)
O-
C
Nicotinamid
(Niacinamid)
N
N
H
NicotinatPRPP
Phosphoribosyltransferase
PP
H
PRPP ist
5-Phosporibosyl1-pyrophosphat
O
i
C
O
P
O
P
N
O
H
OH
H
OH
NH2
Nicotinamidmononucleotid
O
O-
H
O
C
-
O
H
PPi
O
N
O
O-
NicotinamidPhosphoribosyltransferase
PRPP
NH
O-2
O
-
NH2
H
Nicotinatmononucleotid
H
H
OH
H
OH
O
O
C
NH2
C
ATP
NH2
PPi
PRPP ist die aktivierte Form von Ribosephosphat. Neben
der Biosynthese von NAD(P)+ aus dem Vitamin B3, ist
5-Phosphoribosyl-1-pyrophosphat auch eine
Schlüsselsubstanz bei der Biosynthese von Purin und
Pyrimidinnucleotiden und bei der Synthese von Histidin.
Nicotinat-adenindinucleotid O
C
O
-
O
P
N
N
O
O
OH
H
H
OH
H
OH
NAD+Pyrophosphorylase
Ribose
O
O
C O
- OO
C
Adenin
O
P
PPi
O
OH
H
H
OH
H
OH
NAD+Pyrophosphorylase
Nicotinatmononucleotid
Ribose
Pi
Nicotinatadenindinucleotid
NH2
N
H
H
OH
OH
P
O
N
P
N
O
O
H
H
OH
O
O
P
2
1
N
O
H
NAD+
Pi
Pi
Pi
Adenin
NAD+-Kinase:
Ribose
Adenin
NAD+ + ATP  NADP+ + ADP
H
O
Modell der PyruvatDehydrogenase:
DihydrolipoylTransacetylase (E2)Kern
N
O
O
Struktur von
Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADP+)
4
NH2
O
(Ligase)
Ribose
Adenin
O
H
NH2
Pi
Ribose
C
H
C
O
H
O
Ribose
Ribose
N
N
O
NAD+-Synthase
Pi
O- OO
O
-
O
N
N
Ribose
ATP
O-
AMP
ADP++PPi +
Glutamat
NAD+
Pi
Pi
Nicotinamidmononucleotid
ATP +
Glutamin
+ H20
Die reaktive Gruppierung
(= C4-Position des
Nicotinamid) ist bei
NAD+ und NADP+ ident.
PyruvatDehydrogenase
(E1, gelb)
DihydrolipoylDehydrogenase (E3)
O
Pyruvat + CoA + NAD+  Acetyl-CoA + CO2 + NADH
Coenzyme und prosthetische Gruppen der Pyruvat-Dehydrogenase
Cofaktor
Einordnung
Funktion
Thiaminpyrophosphat, TPP An E1 gebunden
Pyruvatdecarboxylierung
Liponsäure
Übernimmt
HydroxyethylCarbanion von
TPP
kovalent an E2
gebunden
Coenzym A (CoA)
Substrat für E2
Flavinadenindinucleotid
NAD+
R
An E3 gebunden
Substrat für E3
H3C
R'
N
Übernimmt die
Acetylgruppe
vom Liponamid
Wird durch
Liponamid
reduziert
Durch FADH2
reduziert
H3C
CO2
S
-
O
H3C
R' TPP-E1
N
R
H3C
H
S
R
C
O
O
C
C
O
O
N
S
C
-
R'
+
CH3
C
C
O
OH
CH3
Bindung der Ketocarbonsäure an die
Ylid-Form des TPP
Pyruvat
Struktur des
Transacetylasekerns (E2)
R'
N
R
C
Die Funktion des Cofaktors Thiaminpyrophosphat in E1 von
Pyruvat-DH ist analog jener in Pyruvat-Decarboxylase von Hefe:
S
C
C
C
O
OH
CH3
HO
C
Jede Untereinheit
besteht aus drei
Domänen:
CH3
einer LiponamidBindungsdomäne,
Hydroxyethyl-TPP-E1
Pyruvat-Dehydrogenase (E1): Decarboxylierung von Pyruvat unter
Bildung von Hydroxyethyl-TPP
einer kleinen
Domäne zur
Wechselwirkung
mit E3 und
Anschließend wird die C2-Einheit an E2 weitergegeben.
Hydroxyethyl-TPP wird durch Liponamid-E2 oxidiert:
einer großen
katalytischen
Transacetylasedomäne
Jede rote Kugel stellt
ein Trimer aus drei E2-Untereinheiten dar
H3C
R
H3C
R'
N
S
R
N
C
H3C
R'
H+
R
S
N
C
Eliminierung
des TPP
S
C
C
HO
HO
H3C
R'
CH3
HO
C
C
R'
N
R
S
C
CH3
CH3
O
C
CH3
S
S
S
S
HS
Liponamid-E2
E2
HS
E2
S
E2
Angriff des Hydroxyethyl-Carbanions am Liponamiddisulfid
HS
E2
Bildung von
Acetyl-dihydrolipoylamid-E2
Acetyl-CoA
CoA
CoA
O
C
Der Lipoyllysyl-Arm von E2 “vermittelt”
im Multienzym-Komplex PyruvatDehydrogenase zwischen E1 und E3.
Auch innerhalb der Lipoyl-Gruppen von
E2 werden Austauschreaktionen
beobachtet:
O
SH
S
C
CH3
CH3
14 Å
HS
S
HS
HS
E2
E2
Dihydrolipoylamid-E2
Acetyl-dihydrolipoylamid-E2
Dihydrolipoyl-Transacetylase (E2) überträgt schließlich die
Acetylgruppe auf CoA unter Bildung von Acetyl-CoA und
Dihydroliponamid-E2.
Lipoyllysyl-Arm (voll
ausgestreckt)
Der Reaktionszyklus von Pyruvat-Dehydrogenase wird schließlich
vollendet, wenn durch die Dihydrolipoyl-Dehydrogenase (E3)
Liponamid regeneriert wird:
Oxidiertes Enzym
enthält reaktive
Disulfidgruppe und
FAD: Reoxidation
von Dihydrolipoylamid durch
Disulfidaustauschreaktion.
Oxidation des
Lipoylamids bei
gleichzeitiger
Reduktion des
reaktiven Disulfids
von E3.
1. Reoxidation der Sulfhydrylgruppen durch FAD
FAD
FAD
2. Reoxidation des FADH2 durch NAD+
SH
S
SH
E3 (reduziert)
S
E3 (oxidiert)
Reduziertes E3 wird durch NAD+ reoxidiert:
NAD+
S
HS
S
E2
FAD
S
SH
HS
NADH + H+
FADH2
FAD
SH
E3 (reduziert)
S
S
S
E3 (oxidiert)
E2
Überblick:
Pyruvat-Dehydrogenase
Multienzymkomplex
DihydrolipoylDehydrogenase
(E3)
PyruvatDehydrogenase
(E1)
DihydrolipoylTransacetylase
(E2)
Pyruvat + CoA + NAD+  Acetyl-CoA + CO2 + NADH
Regulation der Pyruvat-Dehydrogenase
Glucose
Der Multienzymkomplex Pyruvat-Dehydrogenase reguliert den Eintritt
von aus Kohlenhydraten stammenden Acetyleinheiten in den
Citronensäure-Cyclus.
Die Decarboxylierung von Pyruvat durch E1 ist irreversibel
(= exergonischer Schritt im Gesamtzyklus: G‘ etwa –30 kJ/mol) und
stellt daher wieder einen Regulationspunkt dar.
Glycolyse
Gluconeogenese
Pyruvat
Glucose kann auch aus Pyruvat entstehen (siehe Gluconeogenese, siehe
Einheit 9). In tierischen Zellen ist jedoch die Bildung von Acetyl-CoA
aus Pyruvat ein irreversibler Schritt des Stoffwechsels und daher
können tierische Zellen Acetyl-CoA nicht in Glucose umwandeln.
Die oxidative Phosphorylierung von Pyruvat zu Acetyl-CoA bedeutet
für die Kohlenstoffe der Glucose zwei mögliche Schicksale:
a) Oxidation zu CO2 im Citrat-Cyclus
b) Einbau in Lipide
Acetyl-CoA
Citrat-Cyclus
CO2
Drei regulatorische Systeme:
1.
1. Produkthemmung durch NADH und Acetyl-CoA
Fettsäureoxidation
bzw. -synthese
Lipide
Produkthemmung durch NADH und Acetyl-CoA
Konkurrenz von NADH und Acetyl-CoA mit NAD+
und CoA um Bindungsstellen am Enzym
Hohe Konzentrationen an Reaktionsprodukten (NADH,
Acetyl-CoA) hemmen die Pyruvat-Dehydrogenase.
Große Verhältnisse [NADH]/[NAD+] und
[Acetyl-CoA]/[CoA] bewirken, dass E2 in der
acetylierten Form bleibt. E1 kann die
Hydroxyethylgruppe nicht abgeben. TPP bleibt in der
Hydroxyethyl-Form.
2. Kovalente Modifikation durch Phosphorylierung/
Dephosphorylierung der Untereinheit E1
Bei Eukaryoten ist kovalente Modifikation das wichtigste
Mittel der Regulation. Die Phosphorylierung der PyruvatDehydrogenase durch eine spezifische Kinase schaltet die
Aktivität des Komplexes ab. Die Inaktivierung wird durch eine
spezifische Phosphatase wieder aufgehoben.
NADH und Acetyl-CoA treiben somit die
Transacetylase (E2) und die DihydrolipoylDehydrogenase (E3) rückwärts.
3. Das Hormon Insulin induziert die Synthese von PyruvatDehydrogenase (auch von Glucokinase, Phosphofructokinase
und Pyruvatkinase; siehe Einheit 9)
2.
NAD+
Kovalente Modifikation durch Phosphorylierung/
Dephosphorylierung der Untereinheit E1
Nur in eukaryotischen Enzymkomplexen.
CO2
Pyruvat
NADH
E3
HydroxyethylTPP
Liponamid
E1
E2
TPP
Acetyldihydroliponamid
Dihydroliponamid
Acetyl-CoA
CoA
Produkthemmung: NADH und/oder Acetyl-CoA konkurrieren
in den Reaktionen 3 und 5 mit NAD+ und CoA. Die von E2 und
E3 katalysierten reversiblen Reaktionen werden durch
Produkthemmung rückwärts getrieben.
Phosphorylierung durch Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase
und Dephosphorylierung durch Pyruvat-DehydrogenasePhosphatase (am Dihydrolipoyl-Transacetylase-Kern
gebunden)
Kinase:
Inaktivierung von E1 durch
Phosphorylierung eines Serin-Restes
(Phosphorylierung nicht von cAMP
abhängig).
Kinase selbst durch NADH und Acetyl-CoA
aktiviert
Phosphatase: Hydrolyse des Phosphoserin-Restes aktiviert
Komplex
Quecksilber- und Arsenverbindungen sind giftig! Warum?
Aktivatoren
Mg2+
Pi
Ca2+
E1-OH
(aktiv)
ATP
Pyruvat-DHPhosphatase
PyruvatDH-Kinase
E1-OPO32(inaktiv)
H2 O
ADP
Aktivatoren
Acetyl-CoA
NADH
Inhibitoren
Pyruvat,
ADP, Ca2+,
Mg2+
Beide Metalle haben eine hohe Affinität zu (benachbarten)
Sulfhydrylgruppen, so auch zu den reduzierten
Dihydrolipoylgruppen der Pyruvat-Dehydrogenase.
Die Bindung von Quecksilber oder Arsenit (AsO33-) hemmt das
Enzym und führt zu Erkrankungen des Zentralnervensystems!
Für das Nervensystem und Gehirn ist Glucose die wichtigste
Energiequelle. Wird daher ein Schlüsselenzym wie die PyruvatDehydrogenase inhibiert, kommt der Energiestoffwechsel des
Nervensystems praktisch zum Erliegen.
„Hutmacherkrankheit“:
Früher wurde Quecksilbernitrat als
Weichmacher tierischer Felle
verwendet!
Kovalente Modifikation
Ähnliche Probleme hatten frühe Fotografen, die dampfförmiges
Quecksilber bei der Daguerrotypie verwendeten.
Arsenit (AsO33-), bildet kovalente Verbindungen mit Sulfhydrylgruppen,
z.B. mit Dihydrolipoylamid (= zweizähniger Ligand)
Entgiftung mit
Sulfhydrylreagenzien
Gilt auch für methylierte Arsenverbindungen:
R
O
HS
R
S
As
As
R'
HS
R'
R
H2O
S
R