I. Ziele

Projekt 3P3137 Systemology
I. Ziele
Gesamtziel des Vorhabens
Die Funktionsweise der Zelle zu beschreiben und zu verstehen stellt nach dem Abschluss vieler
Genomprojekte die nächste Herausforderung für die moderne Biologie dar. Die Funktion einer
eukaryotischen Zelle beruht auf dem komplexen Zusammenspiel der verschiedenen Zellorganellen und
der darin vorhandenen Proteine. Da dies ein dynamischer Prozess ist, müssen neue Methoden
entwickelt werden, um die Organellfunktion zu analysieren und quantitativ zu erfassen. Dies stellt eine
wichtige Voraussetzung für die Anwendung systembiologischer Methoden dar. Die einzelnen Parameter
müssen dafür mit hoher Präzision erfasst
werden, um eine nachfolgende Modellierung zu
ermöglichen. Dies gilt nicht nur im Hinblick auf
zeitliche,
sondern
auch
auf
räumliche
Parameter. Es ist daher erforderlich geeignete
Analysemethoden zu entwickeln, die sowohl die
Bestimmung
biophysikalischer
als
auch
molekularer Faktoren erlauben.
Das beantragte Projekt befasst sich mit
der
Analyse
und
der
nachfolgenden
Modellierung der Endozytose von Hepatozyten
auf molekularer und biophysikalischer Ebene.
Die Endozytose spielt bei vielen biologischen
Prozessen eine entscheidende Rolle. Sie dient
Systembiologie am Beispiel der
Definition
der
Endocytose
Rezeptortransports in Hepatocyten.
der Aufnahme von Nährstoffen, der Verteilung
quantitativen
und
des
von Transportproteinen zwischen intrazellulären
Kompartimenten sowie einer ausgeglichenen Membranverteilung (Membranfluss). Auch für die
interzelluläre Kommunikation, sei es hormonell oder neuronal, und die Prozessierung und Präsentation
von Antigenen durch die Zellen des Immunsystems, stellt die Endozytose eine wichtige Voraussetzung
dar.
Für
die
Leberfunktion
sind
insbesondere
die
hormonelle
Signalverarbeitung,
der
Glucosestoffwechsel und die Entgiftung von Bedeutung. Hepatozyten besitzen eine polare Organisation
mit einer apikalen und einer basolateralen Plasmamembran, die strukturell und funktional verschieden
sind. Die Endozytose in diesen Zellen unterliegt daher einer besonderen Regulation. Trotz erheblicher
Fortschritte in der Erforschung der Endozytose in anderen Zellen, ist unser Verständnis der Endozytose
von Hepatozyten noch immer sehr begrenzt.
Das Ziel unserer Arbeit ist die quantitative Analyse und Modellierung der Endozytose in isolierten
Hepatozyten. Die Projektpartner werden die Endozytose primärer Hepatozyten mit Hilfe eines
interdisziplinären Ansatzes untersuchen, der die Methoden der Hochdurchsatzmanipulation und –
Mikroskopie, Proteomanalyse, kinetische Analyse und das mathematische Modellieren umfasst.
Desweiteren werden sich die Projektpartner Erkenntnisse aus früheren Experimenten zunutze
machen und das detaillierte Wissen über die molekulare Zellbiologie der Endozytose integrieren, das in
verschiedenen
Sytemen
während
der
letzten
Jahre
1
gewonnen
wurde.
Gut
charakterisierte
Projekt 3P3137 Systemology
Messmethoden zur Fluoreszenz von lebenden Zellen werden angewandt, um die zentralen Vorgänge,
die den endozytotischen Fluss kontrollieren, und die Moleküle, die diesen Vorgängen zugrunde liegen,
zu modellieren. Ziel ist die Entwicklung eines mathematischen Modells zur Endozytose der Hepatozyten.
Die Systemanalyse der Endozytose von Hepatozyten soll zur Formulierung von nachprüfbaren
Hypothesen über die Anpassung der Transportprozesse nach Veränderungen des intra- oder
extrazellulären Millieus führen.
Diese Analyse wird durch das know-how und die experimentiellen Systeme, die von verschiedenen
Teilnehmern des Netzwerks gestellt werden, enorm erleichtert. Zu den Schlüsselfaktoren gehören die
kleinen GTPasen der Rab-Familie, die etablierte Regulatoren des intrazellulären Transports und der
Organellenbiosynthese sind. Endozytotische Organellen (d.h. Endosomen) sind durch die Verteilung der
Rab GTPasen und ihren Effektoren definiert. Rab5 z.B. reguliert den Transport und die Membranfusion
in der frühen Endozytose. Viele der Effektorproteine, die mit rab5 interagieren, wurden identifiziert und
ihre Funktion kann nun im Kontext der Endozytose der Hepatozyten untersucht werden. Die Lokalisation
von Rab5 und dessen Effektorproteine ist auf ein Subkompartiment der frühen Endosomen beschränkt.
Generell ist zu sagen, dass Rab GTPasen funktionelle Untereinheiten in den endozytotischen
Organellen definieren.
Rab Proteine und ihre Effektoren werden in struktureller und funktioneller Hinsicht als
Markermoleküle der Endosomen in Hepatozyten benutzt werden. Ein detailliertes Verständnis der
Funktion dieser Proteine wird ein essentielles Werkzeug für die Modellierung der Endozytose darstellen.
Das Verständnis und die Modellierung der Endozytose soll durch einen multidisziplinären Ansatz erreicht
werden. Wir werden eine Kombination folgender Techniken nutzen:
–
Bildanalyse im Hochdurchsatzverfahren.
–
Zellbiologische und biophysikalische Tests, die auf lebende Hepatozyten abgestimmt werden.
–
Eine systematische, genomumfassende Suche nach neuen Effektoren, die den endozytotischen
Transport beeinflussen.
–
Die erzielten Ergebnisse werden mit den Methoden der Systembiologie integriert und zu einem
Modell der Endozytose unter Berücksichtigung der räumlichen Verteilung der einzelnen
Komponenten zusammengefasst.
Unser Ziel ist aus der Kombination des Wissens über die molekularen Komponenten der
Endozytose mit den neuesten optischen Technologien ein Modell für Transport von der apikalen und der
basolateralen Membran von Leberzellen zu entwickeln. Dieses Modell wird dann benutzt werden um
vorherzusagen, wie bekannte biologische Effektoren der Zelle die endo- und transzytotische Dynamik
beeinflussen, und um durch eine genomumfassende Suche neue Effektoren zu identifizieren.
Die spezifischen Ziele sind:
–
Entwicklung von Hochdurchsatz-Bildgebungsverfahren für Hepatozyten
–
Lokalisierung von
rab-GTPasen und rab-Effektormolekülen im Kontext endozytotischer und
transcytotischer Prozesse
–
Hochdurchsatz-Bildanalyse der Endozytose und des Rezeptortransports
–
Hepatozyten ‘couplets’ als in vivo Transcytosesystem
–
Genomumfassendes RNAi-Screening zur Identifikation endozytotischer Effektoren.
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Projekt 3P3137 Systemology
–
Modellierung endozytotischer Prozesse
Um diese Ziele zu erreichen, haben wir ein leistungsfähiges Konsortium zusammengestellt. Es umfaßt
Experten aus der Universität, aus Universitäts-Kliniken sowie aus Fraunhofer-, und Max-PlanckInstituten, mit Arbeitsschwerpunkten im Bereich Zellbiologie, Molekularer Zellbiologie der Hepatozyten,
Bildgebung
von
lebenden
Zellen,
dynamischer
Quantifizierung
und
systembiologischer
Modellentwicklung.
Diese ergänzen die Expertise von Evotec Technologies, dem weltweit führenden Unternehmen im
Bereich des Hochdurchsatz-Screenings. Der Verbund erfüllt alle Voraussetzungen, um die geschilderten
zellbiologischen Aufgaben erfolgreich zu bearbeiten. Wir sind davon überzeugt, dass die erzielten
Ergebnisse eine entscheidende Komponente des systembiologischen Ansatzes darstellen, der es in
Zukunft erlauben wird, die Hepatozyten in ihrer Gesamtheit zu modellieren.
Bezug des Vorhabens zu den förderpolitischen Zielen des
Systembiologie-Förderprogramms
Das Ziel des vorgeschlagenen Projekts ist die Anwendung einer neuen Schlüsseltechnologie zur
Klärung einer der fundamentalen Fragen der Biologie von Hepatozyten: Wie erfolgt die zielgerichtete
Sortierung von Proteinen in die Kompartimente der Hepatozyten im Kontext der Dynamik von
Endozytose und Endosomen? Die Komplexität dieser Fragestellung erlaubt nur eine Antwort unter
Anwendung von Technologien, die dem neuesten Stand der Technik entsprechen. Unser Ansatz zielt
auf die Verwendung moderner Zellhandhabungssysteme und Bildverarbeitung im Hochdurchsatz ab, die
eine Anwendung zellbiologischer und zellbiophysischer Untersuchungen bei der quantitativen Analyse
des Endozytose-abhängigen und zielgerichteten Proteintransports in Hepatozyten erlauben. Wir werden
diese Untersuchungen nutzen, um ein(e) Genom-umfassende(s) Suche („Screening“) nach EffektorProteinen, die entlang der Bahn der gerichteten Endozytose agieren, zu entwickeln und in die
Anwendung zu bringen. Die so identifizierten Proteine legen damit auch Informationen über ihre
Funktion offen und diese kombinierten Datensätze sind die Voraussetzung zur Modellierung der
Endozytose in einem systembiologischen Ansatz. Diese experimentelle Vorgaben stimmen mit dem
Ziel überein ein ganzheitliches (holistisches), quantitatives und auf lebenden Zellen basierendes System
zu etablieren, welches der Modellierung der Biologie von Endosomen in Hepatozyten dient. Dies
geschieht in enger Übereinstimmung mit den Zielen des Förderprogramms. Unser Konsortium besitzt die
nötige Kompetenz, um einen substanziellen Beitrag zum Netzwerk Systembiologie zu liefern, und die
Realisierung unseres Forschungsvorhabens ermöglicht es Deutschland eine international führende
Stellung in der post-genomischen Forschung einzunehmen. Die Entwicklung der Bildverarbeitung im
Hochdurchsatz verbunden mit einem genom-umfassenden, zellbiologischen Screeningverfahren wird
Deutschland als einen führenden Forschungsstandort im Bereich der „Zellbiologie im großen Maßstab“
und der Systembiologie etablieren. Wir erwarten, dass dies für Deutschland sowohl eine Stärkung der
wissenschaftlichen Gewichtung im internationalen Vergleich bedeutet als auch langfristig zu einem
Wachstum der biotechnologischen Industrie führt.
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Projekt 3P3137 Systemology
Wissenschaftliche
Vorhabens
und/oder
technische
Arbeitsziele
des
Das wissenschaftliche Ziel ist die Etablierung, Anwendung und Auswertung von Bildverarbeitung,
Zellhandhabung und Untersuchung zur Endozytose in Hepatozyten im Hochdurchsatz. Die speziellen Ziele
sind:

Die Einführung und Etablierung der Bildverarbeitung im Hochdurchsatz als Technologie der
Systembiologie für die Charakterisierung von Membran-Transportprozessen in Hepatozyten.

Den Einsatz der Bildverarbeitung im Hochdurchsatz zur Untersuchung von Endozytose und
Membrantransportprozessen unter Berücksichtigung der genomischen Variation.

Die Identifikation und Auflösung rezeptorvermittelter Wege bei endosomalen Prozessen in
Hepatozyten durch Bildverarbeitung im Hochdurchsatz.

Die Schaffung eines neuen Modellierungsmodus/-systems für die räumlich aufgelöste Kinetik des
Endozytose-Wegs mit dem Schwerpunkt gegenwärtig wissensbasierte biophysikalische und
kinetische Daten zu vereinen

Die Etablierung eines Genom-umfassenden genetischen Endozytose-Screenings mit Hilfe von
zellbasierten Untersuchungen.

Der genom-umfassende Erkenntnisgewinn über die Funktion von Proteinen der Endo- und
Transzytose in Hepatozyten

Die Schaffung eines neuen Untersuchungsformats zum funktionellen Screening von Hepatozytenspezifischen und allgemeinen zellulären Aktivitäten.

Die technische Realisierung der kontaktfreien Isolierung und Manipulation von Hepatozyten und
Hepatozyten-couplets.
II. Stand der Wissenschaft und Technik; bisherige Arbeiten
Endozytose
Endozytotischer Membrantransport ist eine fundamentale Eigenschaft lebender Zellen. Die Sortierung,
das Recycling und der Abbau von internalisierten Rezeptoren und Liganden sowie die Weiterleitung von
Proteinen zur Degradation in den Lysosomen wird durch endozytotischen Membrantransport ermöglicht
(Gruenberg and Howell, 1989; Gruenberg and Maxfield, 1995). Der Prozess ist essentiell für
Rezeptorfunktionen, Rezeptor-vermittelte Signaltransduktion und Transzytose über Epithelien und dient
als spezifischer und sorgfältig regulierter Mechanismus, der den Transport von Proteinen zwischen dem
Zellinneren und der Außenwelt in beiden Richtungen ermöglicht. Während die generellen Prinzipien des
Endozytose weges bereits hinreichend gut untersucht sind, kennt man nur sehr wenige Details über die
Vorgänge bei der Endozytose in polarisierten Zellen, insbesondere in Hepatozyten. Das Fehlen einer
umfassenden Liste von beteiligten, regulatorischen Molekülen und quantitativen, kinetischen Parametern
behindert bis heute die Entwicklung aussagekräftiger Modelle von endozytotischen Vorgängen. Ein
weiterer limitierender Faktor ist die vergleichsweise geringe Anzahl an Datenpunkten, die bei der
Verwendung Zell-basierter Experimente gewonnen werden können. Innerhalb des beantragten Projektes
sollen solche Einschränkungen durch eine Kombination von detailiertem Wissen über die molekularen
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Projekt 3P3137 Systemology
und zellbiologische Mechanismen der Endozytose mit hochauflösenden Bildgebungsverfahren
überwunden, und zur Entwicklung von Modellen zum endozytischen Transport genutzt werden.
Alle eukaryotischen Zellen internalisieren ständig Membranbestandteile von der Zelloberfläche
durch Endozytose. Über diesen Weg werden Hormone, aktivierte Rezeptoren und Rezeptor-gebundene
Liganden ins Innere der Zelle transportiert. Der endozytotische Weg wurde mit Hilfe löslicher, Rezeptorgebundener ‚Cargo’ Moleküle, die von der Plasmamembran transportiert werden, charakterisiert. Alle
internalisierten Markermoleküle finden sich innerhalb von 2 bis 5 Minuten in einer distinkten Population
von Organellen der Zellperipherie wieder (Dunn et al., 1989). In den frühen Endosomen dissoziieren die
meisten Liganden von ihren Rezeptoren und werden von den peripheren über die multivesikulären zu
den perinukleären späten Endosomen und schließlich zur Degradation in die Lysosomen transportiert.
Die Mehrheit der Recyling-Rezeptoren nimmt einen anderen Weg und wird mit einer Halbwertszeit von
etwa 3 bis 5 Minuten, direkt an die Zelloberfläche zurücktransportiert (Dunn et al., 1989; Mayor et al.,
1993). Die verbleibenden Recyling-Rezeptoren reichern sich vor ihrem Rücktransport in tubulärvesikulären peri-zentriolären Recycling-Endosomen an (Yamashiro et al., 1984). Die räumliche
Komplexität und Plastizität der Endozytosewege variiert von Zelle zu Zelle. Deshalb war die Entdeckung
der Rab-GTPasen als regulatorische Elemente der Transportmaschinerie, ein wichtiges Element bei der
Aufklärung der Endozytosewege. Diese Familie kleiner GTPasen, die im aktiven, GTP-gebundenen
Zustand Effektorproteine an die Membran binden, liefert kompartimentspezifische Marker für jeden
einzelnen Schritt in der Vesikeltransportkette, angefangen bei der Vesikelbildung über die
Vesikelverkettung bis hin zur Verschmelzung mit dem Zielkompartiment sowie für die Cytoskelettabhängige Organellenbewegung. Rab5 ist dafür das am besten charakterisierte Beispiel aus
Säugerzellen. Es reguliert die Bildung Clathrin-beschichteter Vesikel an der Plasmamembran, die
Verknüpfung und Fusion dieser Vesikel mit den frühen Endosomen, genauso wie die Aktivität
homotypischer Endosomen: Endosomen Fusion und Bewegung von fühen Endosomen entlang der
Microtubuli.
Endozytose in Hepatozyten
Hepatozyten sind auf molekularer und zellbiologischer Ebene eingehend beschrieben und dienen als
Modelsystem für die Polarität epithelialer Zellen. Allerdings ist dieser Zelltyp im Hinblick auf relevante
Parameter für den Transport und die Funktion von Endosomen noch nicht außreichend, und mit einem
adaequaten Spektrum der zur Verfügung stehenden Techniken untersucht worden. Das Verständnis der
molekularen Maschinerie zur Endozytose in Hepatozyten ist immer noch rudimentär. Wir möchten diese
Lücke durch systematische, schrittweise Charakterisierung des polarisierten endozytotischen Transports
in Hepatozyten füllen.
Die Forschungsanstrengungen, die sich auf die molekularen Mechanismen der Endozytose
konzentriert haben, wurden bislang ausschließlich an nicht-polarisierten Zellen durchgeführt.
Hepatozyten gelten traditionell als das beste Modelsystem zum Studium des Membrantransports in
polarisierten Zellen. Wie auch für andere polarisierte Zellen beschrieben (Bomsel et al., 1989) gibt es in
der Hepatozyte zwei biochemisch
unterschiedliche endosomale Populationen: basolaterale frühe
Endosomen und subapicale Endosomen. Vor kurzem konnte gezeigt werden, daß EEA1, eins der
Effektorproteine der Rab5-gesteuerten frühen Endozytose, in beiden Endosomen Populationen
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Projekt 3P3137 Systemology
vorkommt (Tuma et al., 2001). Trotz dieser Erkenntnisse ist nicht klar, wie in der Zelle der Transport
einerseits zu den basolateralen frühen Endosomen und andererseits zu den subapicalen Endosomen
reguliert wird. Zusätzlich unterscheidet sich die Situation in Hepatozyten deutlich von der, die man in
Neuronen vorfindet, wo EEA1 spezifisch nur in den Endosomen der somatodendritischen Domäne der
Zelle nachgewiesen werden kann (Wilson et al., 2000). EEA1 ist nur eines der zahlreichen Rab5
Effektormoleküle, die kürzlich identifiziert werden konnten, und die Aufklärung der endozytotischen
Mechanismen in Hepatozyten wird eine umfangreiche Analyse aller Rab5 Effektoren notwendig machen.
In diesem Zusammenhang gibt es eine Reihe interessanter Fragen. Ist EEA1 der einzige Rab5 Effektor
der in verschiedenen Endosomen-Populationen in polarisierten Zellen vorkommt? Wie funktionieren
andere Effektorproteine, die an der frühen Endozytose beteiligt sind in polarisierten Zellen? Gibt es
verschiedene Gruppen von Rab-Effektoren, die im Zusammenhang mit biochemisch unterschiedlichen
endosomalen Populationen vorkommen – und abschließend, gibt es für jede der unterschiedlichen
endosomalen Domainen eine spezifische Maschinerie? Die polarisierte Hepatozyte stellt ein ideales
System zur Identifizierung der Schlüsselmechanismen polarisierter Endozytose dar.
Bei
der
Untersuchung
von
Endozytose
brachte
die
Anwendung
von
Methoden,
die
auf
Bildgebungsverfahren basieren, entscheidende Fortschritte und die Fluoreszensmikroskopie half bei der
Charakterisierung von Protein- und Ligandentransport innerhalb des endozytotischen Pathways.
Kombiniert mit dem Wissen über die Verteilung von Rab-Domänen innerhalb der Endosomen,
ermöglichen diese Verfahren einen direkten Einblick in die Endozytose der Hepatozyten.
TGF- und Endozytose und Hepatozyten
TGF- ist ein wichtiger Faktor bei der Regulation des Leberwachstums. TGF- steuert die DNASynthese in Hepatozyten und kann aktiven Zelltod bewirken, zum Beispiel, um übermäßige
Gewebemasse zu entfernen. Weiter ist TGF- einer der wichtigsten profibrogenen Mediatoren und
reguliert dabei die Ablagerung von extrazellulärer Matrix (ECM) im Rahmen einer physiologischen
Antwort auf Leberschädigung und Wundheilung, aber auch im pathologischen Sinne während der
Fibrogenese (Dooley et al., 2000; Dooley et al., 2001; Gressner et al., 2002).
Der TGF- Signalweg von den Rezeptoren zum Zellkern ist während der letzten Jahre im Detail
beschrieben worden und stellt sich überraschend einfach und direkt dar (Souchelnytskyi et al., 2002;
Stopa et al., 2000). Im Gegensatz dazu sind Faktoren, die die Qualität der TGF--Antwort definieren,
kaum
verstanden
Aufmerksamkeit
und
die
erfahren.
Da
spezifischen
TGF-
so
regulatorischen
zahlreiche
Mechanismen
potenzielle
haben
Funktionen
bisher
besitzt,
wenig
ist
die
Aufschlüsselung der molekularen Details spezifischer Signalwege für das Verständnis seiner Rolle in
Krankheiten und der Entwicklung wirkungsvoller Therapien wichtig und gleichzeitig kritisch. Die TGF-
Signaltransduktion muss in der gesunden, ruhenden Leber gut ausbalanciert sein; eine Unter- oder
Überrepräsentation scheint einen Anstieg im Turnover von Hepatozyten zu verursachen und sogar das
hepatozelluläre
Karzinom
zu
begünstigen,
wahrscheinlich
als
ein
spätes
Ereignis
in
der
Tumorentwicklung (Akhurst and Derynck, 2001). Die TGF--Polypeptid-Superfamilie bindet an eine neue
Superfamilie von Transmembranserin/Threonin-Kinaserezeptoren. Nahezu alle Zelltypen exprimieren
drei Arten von TGF--Rezeptoren, die man als Typ I-, Typ II- und Typ III-Rezeptoren bezeichnet.
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Projekt 3P3137 Systemology
Kürzlich sind die Rezeptor-Interaktionen bestimmt worden, die für die TGF--Signaltransduktion
erforderlich sind. Der Typ II-Rezeptor ist eine konstitutiv aktive Kinase, die in der Lage ist, freie aktivierte
Liganden zu binden und in der Nachfolge den Typ I-Rezeptor in einen oligoheteromeren (di- und/oder
tetrameren) Komplex zu rekrutieren. Die Phosphorylierung des Typ I-Rezeptors durch den Typ IIRezeptor initiiert (eine) Signalkaskade (n) über Downstream-Effektoren, von denen die Proteine der
Smad-Familie eine fundamentale Rolle spielen. Die Multiplizität der zellulären Antworten von TGF-
werden durch die Stimulierung dieses Rezeptorkomplexes verursacht. Kürzlich ist gezeigt worden, dass
ein wichtiger regulatorischer Mechanismus, der die Spezifität des TGF--Signals bestimmt, den Vorgang
der Rezeptor-Endozytose und des intrazellulären Sortings betrifft, wobei in unterschiedlichen Zelltypen
verschiedene Verhaltensweisen nachgewiesen wurden (Dore et al., 2001). Mit Hilfe von chimären
Rezeptoren,
die
aus
der
Liganden-Bindungsdomäne
des
Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-
stimulierenden Faktor  oder  Rezeptors fusioniert an die Transmembran und zytoplasmatische
Domäne des Typ I- oder Typ II- TGF--Rezeptors bestehen, wurde das Verhalten der TGF-Rezeptoren nach Liganden-Bindung detaillierter untersucht. Innerhalb von Minuten nach LigandenBindung wurden die chimären TGF--Rezeptoren internalisiert. Obwohl alle chimären RezeptorKombinationen ähnliche Internalisierungsraten aufwiesen, erfolgte eine Rezeptor-Herunterregulation nur
nach Aktivierung heteromerer TGF--Rezeptoren. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine effektivere
Rezeptor-Herunterregulation einen Crosstalk zwischen dem Type I- und dem Typ II- TGF--Rezeptor
erfordert, und dass TGF--Rezeptor-Heteromere ein unterschiedliches Transport/Recycling-Verhalten an
den Tag legen (Anders et al., 1997). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass in Abwesenheit des Liganden
sowohl Fibroblasten als auch epitheliale Zellen den Rezeptor-Komplex konstitutiv internalisieren und an
die Plasmamembran zurückrecyclen, was fundamentale Unterschiede zwischen mesenchymalen und
epithelialen Zellen beim endozytotischen Sortieren aufzeigt. Die Daten implizieren weiter, dass die
Liganden-Bindung die heteromeren Rezeptoren aus einem vorgegebenen Recycling-Pool in einen
Signalweg überführt, der Rezeptor-Herunterregulation und Signaltransduktion vermittelt. Zur Zeit sind
keine Daten für TGF--Rezeptor-Endozytose und intrazelluläres Sortieren in Hepatozyten bekannt.
Darüber hinaus ist die Lokalisation der TGF--Rezeptor-Komplexe in polarisierten Hepatozyten bisher
nicht im molekularen Detail untersucht worden. Dies ist jedoch sicherlich aufgrund parakriner Induktion
des Signalwegs durch das TGF-, das von den HSC bereitgestellt wird, von großer Bedeutung. Da die
meisten Zelltypen sowohl TGF--Rezeptoren als auch Liganden produzieren können, beruht die
Regulation der zellulären Responsivität auf der Herstellung von aktivem TGF- und der Präsentation
seiner signalisierenden Rezeptoren. Aus diesem Grund ist die Rolle der Rezeptor-Protein-Assoziationen,
das Turnover der Rezeptor-Komplexe und die Rezeptor-Herunterregulation sehr wahrscheinlich von
großer Bedeutung für die Kontrolle des TGF--Signals und die Modulation der Gesamtheit an zellulärer
Responsivität. Es ist gezeigt worden, dass TGF--II-Rezeptorspiegel mit der TGF--Responsivität
korrelieren. Eine Molekularanalyse zeigte, dass die Signaltransduktion begünstigenden Faktoren Smad
anchor for receptor activation (SARA) und Hrs hauptsächlich in frühen Endosomen von TGF--RezeptorKomplexen lokalisiert sind (Penheiter et al., 2002). Die Blockade der Rezeptor-Endozytose durch das
Wegfangen von intrazellulärem Kalium hat jedoch keinen Effekt auf die TGF--vermittelte Smad27
Projekt 3P3137 Systemology
Phosphorylierung. Die vollständige Aktivierung von Smad2 oder Smad3 und ein downstream-signaling
treten jedoch nur nach endozytotischer Vesikel-Bildung auf. Somit ist die TGF--Rezeptor-Endozytose
nicht einfach ein Weg, um die Signaltransduktion zu unterdrücken, sondern ist im Gegensatz dazu
erforderlich, um das Signal über den Smad-Signalweg zu propagieren. Darüber hinaus wurde die SmurfFamilie von Proteinen identifiziert, eine E3-Ubiquitin-Ligase, die sowohl mit Smad1/5 wie auch mit
aktiviertem Smad2 interagiert. Zusätzlich interagiert z. B. Smurf 2 mit dem transkriptionalen Korepressor
SnoN, das dadurch für die Ubiquitin-vermittelte Degradation durch Proteasomen vorbereitet wird.
Sowohl Smurf 1 als auch Smurf 2 bilden Komplexe mit Smad7 im Zellkern und induzieren die
Translokation von Smad 7 in Zytoplasma (Kavsak et al., 2000; Suzuki et al., 2002) Danach assoziieren
die Smurf-Smad7-Komplexe mit dem TGF- Typ I-Rezeptor und verstärken dessen Turnover. Damit
haben auch Smurf-Smad7-Komplexe eine wichtige Bedeutung für die spezifische Regulation der
Verfügbarkeit von TGF--Rezeptor-Komplexen und auf die nachfolgende Signaltransduktion.
Stand der Technik: Modelling
Das
theoretische
Verständnis
der
Endosom-Dynamik
und
der
zugehörige
Aufbau
einer
Simulationsumgebung ist ein komplexes Unterfangen, dessen, durch verschiedene Längenskalen
definierte Teilprobleme nur teilweise getrennt betrachtet werden können. Notwendig ist die Modellierung
des Wechselspiels verschiedener Beschreibungsebenen, jede ausgestattet mit einer je eigenen
komplizierten Dynamik, das heißt
o
der molekulare Zusammensetzung des Cytoplasmas, des Endosominhaltes und der
verschiedenen vorkommenden Membranen,
o der Genexpression in der Zelle,
o der Dynamik von Lipidstrukturen in der Zelle (z.B. Knospung und Vereinigung von Endosomen),
o der Wechselwirkung von Endosomen mit dem Cytoskelett und dessen eigener Dynamik,
o und der generellen Morphologie der Zelle, einschließlich der Positionierung der in diesem
Zusammenhang relevanten Organellen.
Die Elemente aller dieser Beschreibungsebenen sind, in Hinblick auf die Endosomendynamik,
entscheidend geprägt durch räumliche und zeitliche Strukturbildung und, damit verbunden, unterliegen
stochastischer Variationen (dies, weil selbst auf molekularer Ebene die Anzahl der Kopien einzelner
Systemkomponenten lokal stark limitiert ist).
Der beachtliche Fortschritt in der Theorie der Modellierung der molekularen Maschinerie durch Analyse
von Gen-Knockout und Variations-Assays und findet bereits jetzt breite Verwendung in experimentellen
Arbeiten; dies wurde bereits an anderer Stelle in diesem Gesuch erläutert. Hier konzentrieren wir uns auf
die räumlichen und zeitlichen (Selbst-)Organisationsaspekte biochemischer Reaktionen und ihr
Wechselspiel mit Biophysik von Membranen um Erkenntnisse über die Dynamik von Endosomen zu
gewinnen.
Die aktuelle Biophysik ermöglicht heutzutage bereits hochentwickelte Simulationen von
Ausschnitten verschiedener Membrantypen einschließlich der Effekte eingelagerter Proteine. Damit
stehen Werkzeuge für hinlänglich genaue Voraussagen des Verhaltens größerer, supramolekularer
Strukturen zur Verfügung (Lipowsky, 1999). Zur Anwendung kommen dabei Methoden der molekularen
(Saiz et.al. 2002 , Ayton et.al., 2002) und Brown’schen Dynamik (Ventriglia et.al., 2000 , Noguchi et.al.
2000, 2001) bis hin zu phänomenologischen Modellen (Lipowski, 2001). Die erreichbare Zeitskala
solcher Simulationen auf molekularer Ebene ist meist kurz mit derjenigen der Endosomendynamik
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Projekt 3P3137 Systemology
(Minuten); hingegen was die räumliche Skala betrifft, nähert man sich der Ausdehnung eines gesamten
Endosoms (z.B. 200nm). Im vorliegenden Projekt planen wir den Aufbau einer phänomenologischen
Monte-Carlo-Simulation, die allerdings die Dynamik von Membranen und des Cytoskeletts mit
einschließt. Neben der chemischen Kinetik wird im Speziellen die Diffusion und der aktive Transport von
Biomolekülen (innerhalb und zwischen Kompartimenten und Membranen) berücksichtigt. Bereits
kommerziell
erhältlich
sind
Softwareprodukte
wie
SAAM
(http://www.saam.com)
oder
MCELL(http://www.mcell.cnl.salk.edu), die eine Umgebung zur Verfügung stellen, in welcher detaillierte
Modelle deterministischer Kinetik (SAAM) oder Monte-Carlo-Simulationen von Vesikel-Oberflächen
durchgeführt werden können. Um höhere Integrationsstufen zu erreichen werden wir konventionelle
numerische Simulationstechniken mit zwei neuen Methoden ergänzen (beide in den letzten Jahren
entwickelt von BioMIP). Frühere Untersuchungen der Notwendigkeit stochastischer Simulationen (z.B.
Gend and Kummer, 2002) wurden nicht auf die heterogene Prozessierung in Zellen ausgedehnt, wo der
Einfluss von statistischen Fluktuationen eher noch kritischer ist. Individuenbasierte Modellierung, unter
der Voraussetzung, dass diese hinreichend große Zeitintervalle wiedergeben kann, gestatten eine
nahtlose Einbettung genetischer und molekularer Strukturdetails in das räumliche Gesamtproblem. Dies
wäre ein Vorteil gegenüber phänomenologischer Beschreibungen, welche mehr modellspezifische
Annahmen erfordern.
Momentan
muss,
um
die
Dynamik
eines
Vesikels
als
Ganzes
zu
simulieren,
auf
phänomenologische Modelle zurückgegriffen werden. Dabei gestattet der Stand des Wissens und der
Technik z.B. die Modellierung der Selbstkonstruktion zweilagiger, vesikulärer Strukturen bestehend aus
amphiphiler (Noguchi, 2001), die Reaktion solcher Strukturen auf mechanische Kräfte (Noguchi, 2002)
oder auch Prozesse wie Vesikelknospung (Kumar 2001 Chou 2001). In diesen Studien werden die
Vesikel allerdings immer noch als Zusammensetzung einzelner Moleküle (oder wenigsten Karikaturen
solcher)
betrachtet.
Die
thermodynamische
Modellierung
von
Lipid-Surfaktant-Wasser
Phasendiagrammen vermittels der Verwendung mesoskopischer Größen wie zum Beispiel die lokale
Krümmung der Membranen als Phasenvariable zeigten sich erfolgreich in der Beschreibung von in vitro
Experimenten (Safran, 1996). Die Zeit ist reif, um auch den Einfluss spezifischer Proteine und
Bindungsprozesse an die Endosome-Membran bis hin zur Selbstorganisation der Lipid-Membran zu
erfassen. Es ist unser Ziel, die Lücke zwischen der Beschreibung auf molekularer und der ausschließlich
funktional definierten Zellebene zu schließen. Dies mit einem Modell, welches, obzwar definiert mit einer
räumlichen Auflösung oberhalb molekularer Längenskalen, ein Verhalten zeigt, dass direkt durch
chemische und biophysikalische Vorgänge gegeben ist, und dabei die Menge der nötigen a priori
Annahmen zur Vesikel-Dynamik minimiert.
Die
Wechselwirkung
von
Endosomen
mit
der
Cytoskeleton-basierten,
intra-zellulären
Transportmaschinerie wurde bis dato nur lokal und auf der Ebene molekularer Details oder aber als
stark idealisierter, dafür umfassender Transportprozess modelliert (Emans, 1995). Ein Ziel des
vorliegenden Antrags ist es, das Wissen über die Prozesse auf molekularer Ebene in ein einziges,
dynamisches Modell zu integrieren. Dabei ist die detaillierte Morphologie des Cytoskeletts bereits
vermittels Fluoreszenzmarkierung hinreichend charakterisiert (Autor 1997) aber die heterogenen
Faktoren, welche die Funktion der den Endosomtransport antreibenden Motorproteine bestimmen,
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Projekt 3P3137 Systemology
müssen identifiziert und in das Modell miteingebaut werden. High throughput cellular imaging wird
ergänzt durch eine Standardisierung mit Bezug auf das Zytoskelett und ermöglicht es dadurch, die für
die Endosomdynamik entscheidenden Faktoren herauszuarbeiten.
Stand der Technik: Hochdurchsatz-Bildgewinnung
Die momentan erhältlichen Zell-Bildgewinnungssysteme auf dem Markt sind der “Array Scan II” und der “
Gen II Multi-Dimensional Imager” der amerikanischen Firmen Cellomics und Universal Imaging. Mit dem
“Opera” System ist Evotec Technologies der einzige europäische Wettbewerber und ermöglicht im
Gegensatz zu den beiden Mitbewerbern die für Hochdurchsatz nötige Auflösung und Geschwindigkeit.
Das Opera-System ist für verschiedene Anwendungen geeignet, allerdings sind Modifikationen in Bezug
auf Hardware und Software nötig, um das System auf spezielle Anwendungen anzupassen. Cytocon ist
der momentan einzige erhältliche Hochdurchsatz-Zellsortierer. Um die Software des Systems auf die
geplanten
Hepatozyten-Messungen
anzuwenden,
müssen
jedoch
spezifische
Anpassungen
vorgenommen werden.
Patentlage
Evotec Technologies besitzt oder hat Zugang zu einer grossen Zahl von Patenten, die Instrumentation
und Screening-Systeme, Software, Versuchsgrundlagen und besonders auch Detektionsmethoden und
Algorithmen abdecken. Kürzlich wurden einige Patente für die Opera Technologie eingereicht, die
alternative Wege für Daten der Zell-Bildgewinnung anbieten und Patente der Konkurrenten umgehen.
Des weiteren besitzt Evotec Technologies eine grosse Anzahl eingereichter Patente rund um das
Cytocon System und seinen Anwendungen und bietet damit größtmöglichen Handlungsfreiraum
innerhalb eines Projektes sowie für den Zeitraum danach. Das Endosomenfusionsprinzip ist publiziert
und nicht durch weitere Patente oder bekannte Patentanwendungen eingeschränkt.
Bisherige Arbeiten
Molekulare Grundlagen der Endozytose
Die Arbeitsgruppe von Marino Zerial beschäftigt sich schwerpunktmässig mit der Funktion von Rab
GTPasen. Es ist ihnen gelungen, einige Rab
Proteine
zu
identifizieren,
ihre
intrazelluläre
Verteilung zu beschreiben und ihre Funktion als
Regulatoren
des
Membrantransports
zu
charakterisieren (Zerial and McBride, 2001). Die
Arbeit an Rab5, dem zentralen Regulator des
Membrantransports, hat einen wichtigen Beitrag
zum Verständnis der Rab GTPasen geleistet. So
führt die Expression einer konstitutiv aktiven
Mutante von Rab5 zu einer Stimulierung der Endozytose und induziert eine deutliche Zunahme von
frühen Endosomen (Bucci et al., 1992). In jüngster Zeit sind zahlreiche Proteine identifiziert worden,
10
Projekt 3P3137 Systemology
die GTP abhängig, direkt oder indirekt mit Rab5 interagieren. Die Zahl der Proteine, die der Regulation
von Rab5 unterliegen bzw. den GTP-Zyklus steuern, ist mit Hilfe massenspektrometrischer
Untersuchungen auf 40-50 geschätzt worden. Darüber hinaus sind auf die gleiche Weise einige, mit
anderen endosomalen Rab GTPasen interagierende Proteine gereinigt worden, die an Recycling,
Transzytose und dem Transport zu den Lysosomen (Rab4, Rab11, Rab7) beteiligt sind. Dies
verdeutlicht, dass auch andere Rabs Bestandteile komplexer Regulons sind (Zerial et al., in
Vorbereitung).
Diese Befunde unterstützen die Hypothese, dass Rab GTPasen ein grosses molekulares Netzwerk
von Effektorproteinen regulieren und jede einzelne von ihnen dabei eine spezifische Funktion bei der
Bildung, dem Andocken
und der Fusion von Vesikeln als auch bei deren Actin- und Mikrotubuli-
abhängigem Transport ausübt.
Die Rab GTPasen steuern ein grosses molekulares Netzwerk von Zielproteinen, die sowohl die
Bildung, das Andocken und die Fusion der Vesikel als auch deren Actin- und Mikrotubuli-abhängigen
Transport regulieren. Die Effektorproteine von Rab5, die ihre Funktion gemeinsam ausüben, sind in
speziellen Membranarealen lokalisiert. Die Verteilung von anderen Rab GTPasen ist auf frühe und
rezirkulierende Endosomen beschränkt. So konnten Rab4 und Rab11 in speziellen Membranarealen von
frühen Endosomen lokalisiert werden, die auch als Rab-Areale bezeichnet werden (Sonnichsen et al.,
2000). Basierend auf diesen Befunden haben wir eine neue Hypothese aufgestellt, um die Bildung und
die Organisation der frühen Endosomen zu beschreiben (Zerial and McBride, 2001). Dieses Modell
fordert, dass Endosomen als Mosaik von Rab-Arealen innerhalb eines bestimmten Kompartiments
organisiert sind. Die Rab-Areale entstehen durch die Bindung von Effektorproteinen, die zur Bildung von
räumlich begrenzten und funktionell spezialisierten Bereichen innerhalb der Membran führt.
Divalente Rab Effektoren vermitteln die Kommunikation zwischen benachbarten Rab-Arealen (z. B.
zwischen Rab5 und Rab4 oder zwischen Rab4 und Rab11) und können auf diese Weise den
Proteintransport während des gesamten Endozytose- und Recyclingprozesses steuern.
Die frühe endosomale Rab5 Domäne, die in molekularem Detail bekannt ist, ist eine der
strukturellen und funktionellen Module, die dieses Organell aufbauen (Zerial 2001, siehe Abbildung). Die
Formierung eines Sub-Kompartiments in Endosomen hängt von der funktionellen Zusammenarbeit
zwischen den Effektoren der kleinen GTPase Rab5 sowie von Protein-Lipid und Protein-Protein
Interaktionen ab. Der Rabaptin-5/Rabex-5 Komplex vermittelt die Aktivierung von Rab5, indem es den
Austausch von GDP gegen GTP- an Rab5 katalysiert. Im GTP-gebundenen Zustand interagiert Rab5 mit
einer Vielzahl von Effektoren, so z.B. hVPS34/p150, eine TypIII Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI(3)K).
Die räumlich begrenzte Produktion von PI(3)P ermöglicht die Rekrutierung von Rab5 Effektoren, wie das
Andockprotein EEA1 oder Rabenosyn-5, die dieses Lipid an ihren FYVE Domänen binden. Dies
illustriert das Zusammenspiel zwischen Rab5 Effektoren, da das Enzym PI(3)K das spezifische Lipid
(PI(3)P), welches für die Bindung von EEA1 und Rabenosyn-5 an endosomale Membranen benötigt
wird, generiert. Darüber hinaus bilden die Rab5 Effektoren EEA1 und Rabaptin-5 zusammen mit den
Komponenten des SNARE Systems, Syntaxin 13 und NSF, dynamische oligomere Komplexe auf der
endosomalen Membran. Wegen der räumlichen Koordinierung von Rab und den SNARE Systemen,
scheint die Rab5-PI(3)P Domäne primär in Prozessen der Endosomandockung und –fusion zu agieren.
11
Projekt 3P3137 Systemology
Rab5 reguliert aber auch die Beweglichkeit der frühen Endosomen entlang der Mikrotubuli, die
ausserdem von Lipiden, insbesondere PI(3)P, abhängig ist. Wir vermuten daher, dass die gleiche Rab5PI(3)P Domäne, die die Vesikelfusion steuert auch die Interaktion mit mikrotubuli-assoziierten Proteinen
und/oder Motorproteinen vermittelt, die schliesslich zur Endosomenanheftung an Mikrotubuli und somit
zum Transport führt. Ein Genom- weites in silico Screening nach motorischen Proteinen, die eine
PI(3)P-Bindungsdömane und/oder eine potentielle Effektor-Inderaktionsdomäne enthalten wird dabei
helfen potentielle Zielmoleküle (target) für die Endosomen – Motilität zu identifizieren. Ein
Kandidatenprotein, das eine PX-Domäne zusätzlich zu eine Kinesin-Einheit (motor), Kif 16B, wurde
bereits in Menschen identifiziert und konnte mit der plus-end- gerichteten Motilität von Endosomen in
Verbindung gebracht werden.
Zusätzlich gibt es einige andere Rab5 Effektorproteine, die bisher noch nicht charakterisiert worden sind.
Einige dieser Moleküle könnten Teil der oben beschriebenen Rab5-Domäne sein, während andere den
Transport in einer anderen Endosomenklasse regulieren könnten. Wir wissen von früheren Arbeiten,
dass polarisierte Zellen zwei Klassen
früher Endosomen besitzen, so wie die basolateralen und
subapikalen Endosomen in Hepatozyten. Bei der umfassenden Liste von Effektorproteinen, die
identifiziert wurden, ist es denkbar, dass einige der neuen rab5 Effektoren spezifische Determinanten für
den Transport zu einer bestimmten Endosomenpopulation sind. In Übereinstimmung mit dieser
Hypothese haben wir Anhaltspunkte erhalten, dass ein neuer Multiproteinkomplex, der mit Rab5
interagiert, tatsächlich in einer Population von Endosomen ohne EEA1 lokalisiert ist, und diese sich
somit von basolateralen Endosomen unterscheiden. Der nächste Schritt ist daher, die Verteilung dieses
neuen Effektorkomplexes in polarisierten Zellen zu analysieren, z.B. in Hepatozyten, und seine mögliche
Beteiligung an der polaren Endozytose in diesen Zellen zu testen. Darüber hinaus stellt die
Identifzierung von nachgeschalteten Effektoren für andere endozytotische Mitglieder der Rab-Familie
(Rab4, Rab11, Rab7) eine grosse Menge Regulatorkandidaten für Recycling, Transcytose und den
Transport
zu
den
Lysosomen
in
polaren
Epithelzellen,
wie
Hepatozyten,
bereit.
Diese
Regulatorkandidaten können nun einer funktionellen Analyse zugeführt werden.
Hochdurchsatz-Imaging
Auf grund der technischen Anforderungen bei der Untersuchung von Endozytose-Vorgängen in
lebenden, primären Hepatozyten werden wir Assays verwenden, die bereits erfolgreich zur Analyse
endosomaler Parameter in herkömmlichen Gewebekultur Zelllininen eingesetzt wurden. Dieses umfaßt
Methoden zur Erfassung von Proteinverteilung, Rezeptorsortierung und Ionen-Gehalt von Endosomen,
Endosomengröße, genauso wie dynamische Betrachtungen der Endosomenfusion, (Biwersi et al., 1996;
Emans et al., 1995), alles Parameter, die quantitativ über „Fluorescense Ratio Imaging“ bestimmt
werden können (Gustafson et al., 1998; Sonawane et al., 2002; Zen et al., 1992). Wir werden
hochmoderne Technologien im Bereich von Zell-Handhabung und Hochdurchsatz-Imaging (Evotec
Technologies Opera Plattform: 100’ 000 2 color confocal Bilder/Tag) einsetzen um diese
Fragenstellungen zunächst an einzelnen Hepatozyten und später an Hepatozyten-Couplets zu
untersuchen. Hochdurchsatz-Imaging ermöglicht ein Genom-umfassendes Screening durch den Einsatz
12
Projekt 3P3137 Systemology
Zell-basierter Assays, und bietet damit eine attraktive Plattform für die Bearbeitung systembiologischer
Ansätze.
Hepatozyten Couplets bestehen aus einem Paar von Zellen, die ihre sekretorische und
höchstwahrscheinlich auch ihre endozytotische Polarität beibehalten, während sie eine gemeinsame
apikale Oberfläche teilen (Roelofsen et al., 1998). Dieser Aufbau erlaubt Modeling-basierten Ansätzen
den Einblick in ein System, daß offen für die Manipulation mit neuartigen Methoden zur ZellHandhabung ist, und den Zugriff auf Informationen zu den systemanalytisch relevanten räumlichen und
kinetischen
Parametern
im
Zusammenhang
mit
endozytotischem
und
transcytotischem
Membrantransport erlaubt. Evotec Technologies hat das derzeit modernste System zur ZellHandhabung entwickelt. In einer laminaren Pufferströmung ist es möglich, Zellen ohne physischen
Kontakt lokal zu manipulieren und zu perfundieren. Beispielsweise können Hepatozyten-Couplets
derartig mit Endozytose-Markermolekülen oder Liganden perfundiert werden, so daß diese Moleküle
auschließlich Zugang zur basalen Zelloberfläche haben. Dieses ist ein wichtiger technologischer
Quantensprung mit fundamentale Auswirkungen auf den wissenschaftlichen Fortschritt auf diesem
Gebiet, denn er ermöglicht erstmalig das Arbeiten an lebenden, polarisierten, primären Leberzellen und
die Untersuchung von Zellfunktionen mit Hilfe von quantitativen Bilgebungsverfahren.
Imaging und Modellierung von Endosomentransport und Vesikelfusion in lebenden Zellen
Membran- und Vesikelfusion sind Prozesse, die eine Endozytose
charakterisieren. Mit Hilfe verschiedener Assays in lebenden Zellen und in
zellfreiem Material sind einige Populationen fusiogener Endosomen in nicht
polarisierten
Zellen
bestimmt
worden,
die
beim
Transport
von
internalisierten Liganden beteiligt sind (Gruenberg and Howell, 1989).
Periphere frühe Endosomen werden anhand einer kurzen Inkubation
(1-5 Min.) mit Liganden markiert, die dazu bestimmt sind an die
Plasmamembran zu recyclen (Transferrin) oder zum Sortieren (sorting) zu den sogenannten späten
Endosomen transportiert werden. Nach einer längeren Internalisierungszeit (10-30 Min.) werden der
perinukleären Region internalisierte Flüssigphasen-Marker bereitgestellt. Viele der Daten, die verwendet
wurden, um dieses allgemeine Schema zu konstruieren, stammen aus pulse-chase-Experimenten,
wobei fluoreszierende oder herkömmliche biochemische Marker verwendet wurden, um die
verschiedenen endosomalen Kompartimente über die endozytotische Aufnahme zu markieren.
Wir entwickelten einen real-time Assay zur Quantifizierung der Endosomenfusionen in lebenden
Zellen . Der Test ist sehr robust, sensitiv und erlaubt das Modellieren endosomaler Fusion und zellulärer
Parameter. Der Test ist von Natur aus quantitativ, macht den endozytotischen Signalweg als
vollständiges System verständlich, funktioniert in lebenden Zellen und, was das wichtigste ist, erlaubt
das mathematische Modellieren der Endosomen-Biologie. Aus den vorstehenden Gründen ist dieser
Test von besonderer Bedeutung für die Systembiologie.
13
Projekt 3P3137 Systemology
Die Arbeitsgruppe von N. Emans hat sich auf die Entwicklung von Tests
zur Auflösung von Endozytose in lebenden Zellen spezialisiert (Biwersi
et al., 1996; Emans et al., 1995; Emans et al., 1996; Emans and
Verkman, 1996; Emans et al., 2002). Die Endosomenfusion wurde unter
Verwendung
eines
radiometrischen
Indikators
dargestellt,
der
fusionsabhängig einen zehnfachen Anstieg der Fluoreszenzintensität
erfährt. Der Assay benutzt die Unterdrückung (quenching) der BODIPYFluorophore, wenn diese an Avidin gekoppelt ist. Die Bindung der
Fluorophore an BODIPY erfolgt in der Biotin-Bindungstasche, wo sie
Abb. 2 Fluoresenzverstärkung
von
BODIPY-Avidin
nach
Biotinbindung
durch die sie umgebenden Tryptophanreste gequencht wird. Wenn z. B.
Biotin oder ein biotinyliertes Protein an Avidin bindet, verdrängt dieses das BODIPY, was dann in einer
zehnfach verstärkten Fluoreszenz resultiert (Abb. 2). Dieser Vorgang verläuft schnell mit einer
Halbwertzeit von 25 mSec und unabhängig von den Ionenbedingungen, die in den endozytotischen
Organellen vorliegen.
Diese Verstärkung des BODIPY-Signals kann mit Hilfe des sogenannten Verhältnis-Imaging
(Ratio-Imaging) in lebenden Zellen im Vergleich mit einer Referenzfluorophore sichtbar gemacht und
quantifiziert werden. Das erlaubt die
Kalibrierung des Assays, wobei das
internalisierte
Biotin-gebundene
BODIPY-Avidin
einer
hundertprozentigen
Fusion
entspricht und das nicht mit Biotin
behandelte
BODIPY-Avidin
den
Null-Wert der Fusion simuliert (Abb.
3A).
Die
rote
Fluorophore
Tetramethylrhodamine (TMR) wird
Abb. 3A. Endozytose von BODIPY-TMR-Avidin mit oder ohne maximale
Verstärkung mit Biotin und 3B. Messungen von 100% oder 0% Fusions
als Referenz verwendet, da deren
Fluoreszenzintensität unabhängig ist von der Kopplung von Biotin an Avidin. Die Messung der
Verhältnisse von BODIPY-Signal zu Rhodamin-Signal an einzelnen Endosomen zeigt, dass diejenigen
Endosomen, die das maximal verstärkte BODIPY-Avidin enthalten, von denjenigen, die das nicht
verstärkte BODIPY-Avidin enthalten, leicht unterschieden werden und in Form eines Histogramms
(Anzahl von Endosomen gegen geometrisch ansteigende Werte für das Verhältnis BODIPY/RhodaminSignal) dargestellt werden können (Abb. 3B).
Der Test wird für den Nachweis der Fusion von Endosomen in lebenden Zellen verwendet, wobei der
BODIPY-Avidin-Indikator als ein Flüssigphasen-Marker verwendet wird, um eine Population von
Endosomen durch Internalisierung zu markieren. Eine zweite Population von Endosomen wird durch
Internalisierung von entweder einem Flüssigphasen-biotinylierten Protein oder einem an einen Rezeptor
gebundenen biotinylierten Liganden markiert. Nach der Endosomenfusion wird die BODIPY-AvidinFluorophore durch Bindung an den Biotin-markierten Marker verstärkt und dies wird wie vorstehend
14
Projekt 3P3137 Systemology
beschrieben mit Hilfe des RatioImaging
nachgewiesen.
Wie
es
aufgrund der Struktur und Funktion
des endozytotischen Signalweges
vorhergesagt wird, kann dann ein
Fusionssignal
nachgewiesen
werden, wenn BODIPY-Avidin und
der biotinylierte Marker in Serien
internalisiert werden und die beiden
Marker sich durch Endosomenfusion
vermischen. Wenn z. B. auf eine 10
Abb.4
Endosomen: Endosomen - Fusion in lebenden Zellen
gemessen als Funktion des Zeitintervalls zwischen BODIPYAvidin- und biotinyliertem Marker-Aufnahme. Monte CarloSimulation wird mit den aktuellen Daten in Übereinsteimmung
gebracht (rechte Abb.).
Min. Aufnahme von BODIPY-Avidin
eine 10 Min. Aufnahme eines Biotin-markierten Flüssigphasen-Markers erfolgt, fusionieren nahezu 50%
der markierten Endosomen (Abb. 4). Der Einschub eines Zeitintervalls (0-20 Min.) vor der
Internalisierung des Biotin-markierten Markers führt zu einer schnellen Abnahme des Grades an
nachweisbarer Fusion. Wir modellierten diesen Vorgang unter Verwendung eines Monte-Carlo-Ansatzes
und fanden heraus, dass die Daten mit lebenden Zellen sehr gut übereinstimmten mit einem Modell, in
dem endosomale Marker kurzzeitig in einem fusiogenen Kompartiment angesammelt wurden, bevor der
Weitertransport in Richtung späte Stadien des endozytotischen Signalweges erfolgte (Abb. 4,
Intermediäres Kompartiment). Wir gehen davon aus, dass es sich dabei um ein frühes endosomales
Kompartiment handelt.
Aus den vorstehenden Gründen ist die Endosmonenfusion eine Kenngröße, die modelliert werden
kann, und wird mit dem Fokus auf die Rab5 GTPase und deren Effektoren, was Gegenstand dieses
Antrags ist, ein leistungsfähiges Werkzeug für das Modeling der Rolle dieser Proteine in dem
Gesamtprozeß der Endozytose sein. Unser Ziel ist diesen Test auf die Anwendung mit Hepatozyten zu
optimieren, indem wir räumliche Information hinsichtlich der fusiogenen Kompartimente und deren
Rab-Domänen-Zusammensetzung einbeziehen.
Modellierung
Arbeitsgruppe BIOMIP
Die Gruppe von McCaskill hat jahrelange Erfahrung in der Kombination theoretischer Modellierung und
Experimenten auf dem Gebiet der räumlich aufgelösten und stochastischen in vitro Evolution. Die
Modellierung kombinatorisch komplexer Molekülverbände, die zeitlich langreichweitige Simulation von
Prozessen mittels der Verwendung spezieller Hardware, die Untersuchung räumlich strukturierter
Systeme, komplexer nicht-linearer Prozesse und stochastischer Kinetik bilden einen reichen
Erfahrungshintergrund für die im beschriebenen Projekt nötigen Modellierungsaufgaben. Im Speziellen
verfügt BioMIP über große Erfahrung in der Entwicklung von Modellen basierend auf den Resultaten von
high-throughput-imaging Experimenten auf der Mikroskala, was den Schwerpunkt des Projektes bildet.
Erfahrung in der speziellen Modellierung intrazellulärer Prozesse ist vorhanden bei anderen Mitgliedern
dieses Konsortiums (z.B. Deutsch, Emans) und ebenso bei anderen Gruppen, welche am System
15
Projekt 3P3137 Systemology
Biologie Programm zur Konstruktion einer Modellierungsplattform beteiligt sind (z.B. Heinrich). Das
Know-How von BioMIP in den folgenden Gebieten wird die Implementierung einer neuartigen
Modellierungsstrategie im Rahmen dieses Antrages ermöglichen:
1.
2.
3.
4.
5.
Räumlich heterogene Biochemie.
Automatenbasierte, diskrete Modellierung biochemischer Prozesse.
Modellierung molekularer Rechenprozesse (DNA-Computing).
Synthetische Modellierung biochemischer Prozesse in Mikrofluidik-Reaktoren.
Stochastische Modellierung von biochemischen Evolutionsprozessen in MultikompartimentenSystemen (PRESS).
6. Massivparallele Datenverarbeitung auf rekonfigurierbarer Hardware.
7. Räumlich aufgelöste Echtzeit-Einzelmoleküldetektion.
Musterbildung
durch
Wanderwellen
kann
in
enzymatischen
Amplifikationsreaktionen
Konzentrationsgradienten über zwölf Größenordnungen aufrechterhalten(Bauer et.al. 1989). Solche
Wellen sind nicht beschränkt auf Ca2+ in Zellen sondern können auch spezifische Proteine beinhalten.
McCaskill entwickelte neuartige Techniken zur Modellierung der Kinetik von MultikomponentenProzessen in Wanderwellen (Bauer et.al. 1989) und diese Methode fand Anwendung bei der
Untersuchung viraler Infektionen von Bakterien (Yin and McCaskill 1992). Die Theorie wurde auch
experimentell durch Verwendung von high throughput fluorescence imaging verifiziert (McCaskill et.al.
1993). Die Auswertung mehrerer Tausend Bilder ermöglichte den Aufbau einer Datenbank zur
Erfassung der Statistik evolutionärer Anpassung in derartigen, heterogenen Systemen.
Die Modellierung biochemischer Prozesse zwischen Molekülen aus kombinatorisch grossen
Familien oder Molekülen, die nicht im voraus bestimmte Reaktionswege beschreiten können gestattet
keine a priori Bestimmung der kinetischen Parameter. Der automatenbasierte Modellierungsansatz
spezifiziert eine algorithmisch gegebene Relation zwischen Struktur und Funktion, welche sowohl
deterministisch als auch stochastisch Reaktionsraten festlegen kann. Solche Ansätze wurden zuerst in
der Modellierung der molekularen Selbstreplizierung angewandt (McCaskill 1988) und später auf
komplexer Ökosystemdynamik ausgedehnt (McCaskill 1997). Dabei richtete sich ein besonderes
Augenmerk auf die Differenz zwischen stochastischer und individuenbasierter Reaktionsmodellierung
(McCaskill,
1984).
Weiterentwicklungen
Der
davon)
Gillespie-Algorithmus
wurden,
im
der
Kontext
stochastischen
der
Kinetik
Evolutionsforschung,
(und
diverse
verglichen
mit
individuenbasierter Modellierung (Altmeyer 2001). Räumlich strukturierte, automatenbasierte Modelle
waren das Thema verschiedener Arbeiten in McCaskill’s Gruppe (Tangen 1993 , Thurk 1992). Speziell
untersucht wurde die räumlich aufgelöste, stochastische Kinetik der Evolution der optimalen RNAExpression des in vitro amplification Systems basierend auf dem T7 Virus (Breyer 1997).
Die Fähigkeit zur Modellierung kombinatorisch komplexer molekularer Systeme zeigte ihren Wert
exemplarisch beim durch die Theorie geleiteten Design eines integrierten DNA Computers (McCaskill
2000). Dabei entscheidend waren Simulationen und Experimente zur nichthomogenen Kinetik der DNAHybridisation aus kombinatorisch vielfältig zusammengesetzten Populationen an magnetische
Mikrobeads. Designs für skalierbare high throughput assays für Anwendungen im DNA-Computing sind
entwickelt worden; die zugehörigen Experimente erfordern Fluorescence-Imaging Technologien mit
hoher räumlicher Auflösung (Penchovsky, 2002).
16
Projekt 3P3137 Systemology
Rein theoretische Berechnungen sind häufig zu abstrakt, um für die experimentelle Anwendung
von Nutzen zu sein, währenddem Experimentalisten es verpassen, bereits in frühen Planunsgstadien
Nutzen aus theoretischen Resultaten zu ziehen. Das Design experimenteller Mikrostrukturen, welche
sich auch zur Überprüfung theoretischer Resultate eignen, war und ist ein Schwerpunkt der Aktivitäten
von BioMIP. Im Speziellen wurden mikrofluidik-basierte, in vitro high-throughput Systeme durch ein
multidisziplinäres Forscherteam geplant, gebaut und getestet. Anwendungen finden diese Ergebnisse
bei der Beantwortung grundlegender Fragen der Evolution, in der evolutiven Biotechnologie, der
molekularen Diagnostik und im DNA-Computing. BioMIP verfügt über Erfahrung in der Produktion
programmierbarer, mit einer Bildverarbeitungskomponente ausgestatteter, experimenteller highthroughput Systeme.
Die räumlich strukturierte Kinetik biomolekularer Evolution in Multikompartimentensystemen hat mit
den Anforderungen an die Modellierung des Endocytosisprozesses viel gemeinsam. Die PRESSMethode, erstmals präsentiert in (Mccaskill et.al. 2001), liefert eine Plattform zur effizienten
Untersuchung
der
Auswirkungen
der
Co-Lokalisation
von
Reaktionskomponenten
in
Multikompartimentensystemen unter verschiedenster kinetischer Bedingungen (Altmeyer, 2002 Füchslin
et.al. 2002 Altmeyer et.al. 2002). Die PRESS-Methode, welche in ihrer einfachsten Form die
Reaktionsdynamik auf einer beliebig großen (inklusive unendlich) Anzahl Kompartimenten, welche mit
einer Simplextopologie verbunden sind, beschreibt, kann fundamentale Fragen betreffend der
Wahrscheinlichkeitsverteilung
verschiedener
chemischer
Inhalte
anderweitig
identischer
wechselwirkender Vesikel liefern.
Die Simulation eines räumlich ausgedehnten Reaktionssystems das eine kombinatorische Vielfalt
von Komponenten enthalten kann, ist vom Rechenaufwand her extrem aufwändig. BioMIP konzentriert
eine einzigartige Kombination von Wissen und Erfahrung auf dem Felde der direkten Implementierung
biochemischer Reaktionssysteme in rekonfigurierbare, FPGA-basierte Hardware (McCaskill et.al. 1997).
Solche experimentellen Computer wurden in BioMIP gebaut und detailliertes Wissen über die speziellen
Anforderungen der Simulation biochemischer Vorgänge konnte in den vergangenen Jahren erworben
werden (Füchslin et.al. 2002 Tangen et.al. 2002). Die Verwendung dieser Technologien erlaubte
grundlegende Untersuchungen, die anderweitig nicht realisierbar gewesen wären (Breyer et.al. Füchslin
et.al. 2001).
Die theoretische Modellierung und das Design einer Fluoreszenz-basierten Schnittstelle zur
Dynamik einzelner, freier Moleküle in Lösung und in der Nähe komplexer Strukturen ist seit Jahren
Gegenstand von Arbeiten (jetzt geleitet durch Dr. Mathis) in der BioMIP-Gruppe (Mathis, 1997). Die
Gewinnung von Information über die Trajektorien einzelner Moleküle aus high-throughput Bildsequenzen
wurde ist nun in Echtzeit möglich dank des Einsatzes rekonfigurierbarer elektronischer Hardware, die
selbst wiederum ursprünglich zur Simulation von biochemischen Systemen entwickelt wurde (s. oben).
Diese nicht-konfokale Methode der Einzelmoleküldetetktion ergänzt die gebräuchliche konfokale highthroughput-imaging Ausrüsting von Evotec. Die Erfahrung in der Analyse von stochastischen
Schwachlichtbildern wird die Integration der Modellierung und der high throughput imaging componentKomponente ermöglichen. Zusätzlich sollte es möglich sein, mit Hilfe der Einzelmoleküldetektion
Information über die Mobilität von Molekülen in der Zelle zu gewinnen.
17
Projekt 3P3137 Systemology
Arbeitsgruppe Deutsch
Im Fokus der Gruppe Deutsch steht die Untersuchung ''kooperativer Phänomene in zellulären
Systemen'' (Alt,Deutsch,Dunn 1997 , Deutsch,Falcke,Howard,Zimmermann 2003). Biologische Zellen
haben eine Vielzahl von Interaktionsmöglichkeiten entwickelt, deren komplexes Zusammenspiel die
Entwicklung biologischer Struktur und Funktion bedingt. Aus der Interaktion molekularer und zellulärer
Komponenten erwachsen kooperative Phänomene (z.B. die Entstehung von Molekül- oder Zellclustern).
Erst ein Verständnis der Dynamik kooperativer Effekte auf molekularem und zellulärem Niveau
ermöglicht Antworten auf Schlüsselfragen der Biologie (Deutsch 1999 , Deutsch und Dormann 2002).
Gemeinsam ist kollektiven Phänomenen, dass sie als Ergebnis komplexer Interaktion einer großen Zahl
von Komponenten (insbesondere Moleküle, Zellen) entstehen.
Für die Analyse solcher Systeme und ein Verständnis ihrer Funktionalität sind Simulationsstudien
und eine mathematische Analyse unerlässlich. Vordringliches Problem ist die Entwicklung eines
mathematischen, konzeptionellen Rahmens für die Interpretation von Daten und Experimenten in
biologischen Systemen. Ein Verständnis kooperativer Phänomene ist insbesondere auch entscheidend,
um
pathologische
Situationen
charakterisieren
zu
können.
Hauptfrage
ist
immer
das
mathematisierungspotential eines gegebenen Problems, d.h. welche Fragen sich mit biologischen
Experimenten, welche nur mit Hilfe mathematischer Modelle untersuchen lassen. Die für das beantragte
Projekt relevanten Forschungsschwerpunkte der Deutsch Gruppe liegen in folgenden Bereichen:
1. Mathematische Modellierung raum-zeitlicher Strukturbildung in interagierenden Zellsystemen
2. Entwicklung zellulärer Automatenmodelle für biologische Systeme
1. Raum-zeitliche Strukturbildung wird vor allem in Mikroorganismen (Bakterien) sowie beim
Tumorwachstum
untersucht.
Die
Modellierungsanstrengungen
richten
sich
u.a.
auf
Strukturbildungsphänomene bei Myxobakterien und Hefen sowie beim avaskularen Tumorwachstum
(Börner et al. 2002 , Dormann, Deutsch 2002). Durch die mathematische Modellierung werden
Prinzipien raum-zeitlicher Strukturbildung deutlich, die sich nur durch das biologische Experiment nicht
erkennen ließen. So ermöglicht Modellierung und Simulation die Charakterisierung der Bedeutung
lokaler (z.B. Adhäsion) und nichtlokaler Wechselwirkung (z.B. Signaling) für biologische Strukturbildung
wie z.B. die Ausbildung von Domänen (Deutsch 2000).
2. Zelluläre Automatenmodelle sind diskrete dynamische Systeme, die sich besonders zur Modellierung
interagierender Zellsysteme eignen (Deutsch, Dormann 2003). Mit Zellulären Automaten lassen sich
einzelne Moleküle oder Zellen beschreiben. Je nach interessierender Skala bezeichnen dabei
Automatenzellen individuelle Moleküle oder Zellen. In den letzten Jahren wurde eine Reihe von
Automatenmodellen von uns entwickelt, die sich zur Modellierung, Simulation und Analyse kooperativer
Phänomene in interagierenden Zellsystemen eignen. U.a. wurden Modelle für lokale und nichtlokale
Wechselwirkungen (Adhäsion, Signaling, Chemotaxis usw.) erarbeitet (z.B. Bussemaker et al. 1997 ,
Moreira, Deutsch 2002). In jüngster Zeit wurden hybride Zelluläre Automatenmodelle vorgestellt, in
18
Projekt 3P3137 Systemology
denen
diskrete
Komponenten
(z.
B.
Zellen)
und
kontinuierliche
Komponenten
(z.B.
Signalstoffkonzentrationen) interagieren (Dormann, Deutsch 2002). Hybride Modelle lassen sich auch
zur Beschreibung und Analyse der Entstehung molekularer Domänen (z.B. Rab5) einsetzen, falls einige
Komponenten individuell, andere hingegen nur als Konzentrationen im Modell berücksichtigt werden
sollen. Zelluläre Automatenmodelle bieten enorme Vorteile bei der Simulation, da sie sich direkt in
parallelen Algorithmen implementieren lassen. Insbesondere bei der Simulation von Systemen mit einer
großen Zahl von Komponenten mit komplexen Wechselwirkungen ist dieser Aspekt von enormer
Bedeutung.
III. Detallierte Beschreibung der Projektstruktur
Das angestrebte Ziel dieses Projekts besteht in der Entwicklung Modells der Endozytose für
Hepatozyten orientiert an systembiologischen Vorgaben. Dieses Modell soll durch die Kombination von
Hochdurchsatz-Bildverarbeitung, Molekularer Zellbiologie, Genomik, Bioinformatik und biophysikalischen
Untersuchungen der Endosomen dieser Zellen in einem systembiologischen Ansatz entstehen.
Als Grundlage für die Modellentwicklung verfolgen wir folgendes Prinzip. Der Verlauf der Endound Transzytose ist gekennzeichnet durch eine dynamische Veränderung der Endosomen und in/an
diesen vorhandene Rezeptor-Liganden-Komplexe werden durch Organellen geleitet, die räumlich,
morphologisch und funktionell unterschiedlicher Natur sind. Proteine, die über den Endozytose Weg
transportiert
werden,
sind
in
den
verschiedenen
Organellen
sich
dynamisch
physikochemischen (z.B. pH-Werte und Ionenstärken) und biologischen
veränderten
(Regulatorproteine des
Endozytose-Wegs) Umgebungen ausgesetzt. Aus diesem Grund wird das Prinzip angewendet werden
die
Organellen
anhand
von
Endozytose,
sowie
des
Endozytose-Wegs
Untersuchungen
des
der
2.
2.LOKALISIERUNG
LOKALISIERUNG
„Membran-Recyclings
3.
3.&& 9.
9.ASSAYS
ASSAYS
der Endosomen-Fusion, -Dynamik
55&&66HTS
HTS
und -Beweglichkeit zu definieren. Diese
Begriffsbestimmungen
Definitionen
der
werden
mit
EXPERIMENT
6.
6.RNAi
RNAiSCREENING
SCREENING
den
Zellkompartimente
6.
6.VALIDIERUNG
VALIDIERUNG
entsprechend ihres Gehalts an essentiellen
8.
8.MODELLIERUNG
MODELLIERUNG
Regulatorproteinen des Endozytose-Wegs
verknüpft. Diese beiden Datensätze werden
die Referenzpunkte und damit das Rückgrat
Abb. 3.0
THEORIE
4.
4.POLARES
POLARES
MODELL
MODELL
für die Modellentwicklung bilden.
Einer der wichtigsten Aspekte in der Projektstruktur wird die Identifikation regulatorisch aktiver
Proteinen des Endozytose-Wegs sein. Dies soll durch visuelle Untersuchungen des Endozytose-Wegs
im Hochdurchsatz in Kombination mit der RNAi-Technologie verwirklicht werden. Darüber werden
sowohl neue Kontrollfaktoren als auch neue Kontrollpunkte des Endozytose-Wegs aufgeklärt werden
und die so gewonnen Daten werden die Robustheit des Modells verbessern.
Der Endozytose-Weg wird durch die Lokalisierung der rab-GTPasen sowie derer EffektorMolekülen, die die Identität der Zellkompartimente mit der Spezifität eines zielgerichteten Endosomen
19
Projekt 3P3137 Systemology
transports verknüpfen, definiert werden. Die Funktionen dieser Regulatorproteine –insbesonders der
Effektoren von Rab5 - im endozytotischen „Verkehr“ sind gut verstanden. Diese Proteine werden sowohl
in Dünnschnitten der Leber als auch in primären Hepatozyten von WT und transgenen Mauslinien, die
Fusionsproteine von Rab4, Rab5, Rab7 und Rab11 als translationale Fusion zu verschiedenfarbigen
Varianten des Grün Fluoreszierenden Proteins (GFP) exprimieren, lokalisiert.
Die Lokalisierung von Fracht-Rezeptoren im Vergleich zu Rab-Proteinen, Rab-Effektoren und anderen
Komponenten der endosomalen Transportmaschinerie, die durch den RNAi-basierten genomischen
Ansatz identifiziert werden sollen, wird ebenso in diesen zellulären Systemen ermittelt werden.
Basierend auf diesen Hepatozyten oder polaren Hepatozyten ‚couplets’ wird einer Methode entwickelt
werden, um den Transport der Fracht und der Rezeptor-Liganden-Komplexe über beide, den Endo- und
den Transzytose-Weg, in einem polaren zellulären System zu untersuchen.
Der technologische Schwerpunkt dieses Projekts ist die Anwendung von Bildverarbeitung und
Zellmanipulationsplattformen bei hohem Durchsatz, um ein Modell des Endozytose-Wegs entsprechend
systembiologischer Vorgaben zu generieren. Dies stellt somit den Kernpunkt dieses Projektantrags, um
die entscheidenden Schritte in Richtung des Modells vorzunehmen: die hochqualifizierte und
standardisierte Datenaufnahme endosomaler Eigenschaften, die genomumfassende Suche neuer
Faktoren des Endozytose-Wegs und die Verknüpfung diese Aspekte mit Untersuchungen zur
Endozytoseaaktivität.
Es muss hervorgehoben werden, dass in der Projektstruktur der experimentelle Fortschritt und die
Verbesserungen bei der Modellentwicklung miteinander verwoben sind. Um ein validiertes Modell des
Endozytose-Wegs zu entwerfen, werden standardisierte experimentelle Daten benötigt, die im
Gegenzug anhand der Vorhersagen des Modells überprüft werden können und somit auch die Voll- und
Beständigkeit der Ausgangsparameter überprüfbar machen. Im Falle von Widersprüchen sollen die
Voraussagen des Modells eingebaut werden, um die Richtung der experimentellen Untersuchungen zu
präzisieren. Diese aktive und interdisziplinäre Projektstruktur ist damit im Vergleich zu einer reinen
Wissensintegration weitreichender.
Zusammenfassend zielt dieser Projektantrag auf
die Entwicklung einer Hochdurchsatz
Bildverarbeitungs- und Screeningtechnologie ab, um ein Modell des Endozytose-Wegs in Hepatozyten
zu entwickeln. In diesem Sinne wird eine systembiologisch orientierte Definition des Endozytose-Wegs
angestrebt (siehe Abb 3.0).
Projektstruktur
1.2. LOKALISIERUNG PROTEINE
3. ENDOSOMEN ASSAYS
Das Projekt ist in
unterteilt
und
der
4. POLARER
HEPATOZYTEN ASSAY
10 spezifische Aufgaben
Projektverlauf
ist
5. HOCHDURCHSATZUNTERSUCHUNGEN
in
6. RNAi SCREENING
Abbildung 3.1 aufgeführt.
7.TECHNOLOGIE ENTWICKLUNG
Die Aufgaben sind:
Arbeitspaket
1:
8. MODELLIERUNG
Aufarbeitung
9. ENDOZYTOSE-ABHÄNGIGES TGF--REZEPTOR-TRAFFICKING
von
10. PROJEKTMANAGEMENT
Hepatozyten
Jahr 1
Abb. 3.1 Projektverlauf
20
Jahr 2
Jahr 3
Projekt 3P3137 Systemology
Arbeitspaket 2: Lokalisierung von am Endozytose-Weg beteiligter Proteine
Arbeitspaket 3: Definition der Endosomen-Dynamik
Arbeitspaket 4: Entwicklung eines Assays zur Polaren Endozytose in Hepazyten ‚couplets’
Arbeitspaket 5: Anwendung von Hochdurchsatzuntersuchungen und Datenaufnahme
Arbeitspaket 6: RNAi-gestützte, genomumfassende Screening nach Hepatozyten-spezifischen
Endozytose-Faktoren
Arbeitspaket 7: Entwicklung einer Technologie-Plattform zum Aufbau des Endozytose-Modells
Arbeitspaket 8: Modellierung des Endozytose-Wegs
Arbeitspaket 9: Endozytose-abhängiges TGF--Rezeptor-trafficking und Signaltransduktion
Arbeitspaket 10: Projektmanagement
Arbeitspaket 1: Aufarbeitung von Hepatozyten und Etablierung des Imaging
Im Rahmen dieses APs sollen Primärzellen von Hepatozyten isoliert und für das Projekt Verfügung
gestellt
werden.
Das
Verarbeitungssystems,
zweite
das
die
Ziel
von
AP1
Untersuchung
liegt
des
im
Aufbau
eines
Endozytose-Wegs
Bildaufnahme-
anhand
und
immobilisierter
Hepatozyten erlaubt. Eine mittelfristige Aufgabe innerhalb von AP1 liegt ferner in der Etablierung einer
standardisierten Produktion funktionaler Hepatozyten Couplets zur Entwicklung des Transzytose-Assays
an lebenden Zellen (vgl. AP4).

Unterpunkt 1.1 Isolierung von Hepatozyten und (erste) Markerevaluierung:
Bis das humane Hepatozyten-System für die zellbiologische Plattform verfügbar wird stellen primäre
Maushepatozyten das Modellsystem für dieses Projekt dar. Die Bereitstellung dieser Quelle
standardisierten Zellmaterials ist eine Notwendigkeit für das gesamte Projekt. Über eine limitierte
Collagenase-Behandlung und Zentrifugations Elutriation werden Hepatozyten als polare Zellcouplets
isoliert. Unter Verwendung der Cytocon 300 dielektrophoretischen Zelle werden standardisierte
Protokolle für die Zellisolierung, deren Handhabung und Immunfluoreszenzmarkierung etabliert werden.
Marker für die Organellen des Endozytose-Wegs werden auf ihre Eignung hin überprüft für die
Proteinlokalisierung, die Positionsbestimmung von Organellen und zum Nachweis von „Cargo-ProteinWegen“ geeignet zu sein. Als Qualitätskontrolle für diese Experimente dienen Marker des sekretorischen
Membranfluxes sowie Marker für Mitochondrien und Peroxisomen.

Unterpunkt 1.2 Hepatozyte Imaging Plattform:
Notwendig für die Immunfluoreszenzmarkierung unter Einsatz von „Biorobotern“ ist die Immobilisierung
des Zellmaterials. Als Unterlagen für das automatisierte Hochdurchsatz-Imaging werden Glas, Folie und
gelatinebeschichtete Mikrotiterplatten getestet indem der Quotient aus Anhaftungsfähigkeit zur
Überlebensfähigkeit der Zellen ermittelt wird.

Unterpunkt 1.3 Fluoreszenzbildgebung immobilisierter Hepatozyten
Die optimalen Bedingungen zur Fluoreszenzmarkierung und Manipulation adhäsiver primärer
Hepatozyten müssen ermittelt werden. Die immobilisierten Zellen werden dafür mit diversen
Vitalfärbetechniken und Antikörper-basierten Visualisierungstechniken für die unterschiedlichen
Zellkompartimente markiert, um eine Validierung des Trägersystems der Hepatozyten im Vergleich zur
konventionellen Methodik zu ermöglichen.
21
Projekt 3P3137 Systemology

Unterpunkt 1.4 Handhabung von Hepatozyten Couplets
In AP1 werden weiterhin die dielektrophoretischen Chipsysteme zur Handhabung von Hepatozyten und
isolierten Hepatoyzten Couplets getestet. Die Schlüsseltechnologie dafür steuert EvoTec mit dem
Cytocon 300 bei.
Arbeitspaket 2: Lokalisierung am Endozytose-Weg beteiligter Proteine
Das spezifische Ziel von AP2 liegt in der Identifizierung der subzellulären Verteilung von am
Endozytose-Weg beteiligten Poteinen in i) Wildtyp und ii) transgenen Mauslinien, die Fusionsproteine
der Endozytose- und Endosomen-Transport-Maschinerie exprimieren.
Die Zielgewebe der Lokalisierung sind 1) Leber-Dünnschnitte und 2.) isolierte, lebende Hepatozyten der
Wildtyp/transgenen Mäuse als 2a) Einzelzellen und als 2b) isolierte Zell Couplets.
Das kurzfristige Ziel ist die Lokalisierung der Rab-Effektoren und anderer Komponenten der EndozytoseMaschinerie durch (Immun)fluoreszenzmarkierung. Für primäre Hepatozyten sollen die Proteine durch
internalisierte
Fluoreszenzmarker,
wie
spezifisch
markierte
Rezeptor-Liganden-Komplexe
oder
Antikörper, lokalisiert werden. „Pulse-Chase“-Experimente mit diesen Markern definieren nachfolgend
die unterschiedlichen Stadien des Endozytose-Wegs. Die Zellen werden weiterhin fixiert und auf die
Lokalisierung der Immunfluoreszenz von Rab-Proteinen und Rab-Effektoren hin im Opera-System
analysiert. Das mittelfristige Ziel ist der Ausweitung der bildgebenden Opera-Technologie auf
Leberdünnschnitte transgener Mäuse, die durch fluoreszierende Fusionsproteine von Rab4, Rab5, Rab7
und Rab11 gekennzeichnet sind. Diese Proteine repräsentieren kompartimentspezifische Marker des
Endozytose-Wegs. Als langfristiges Ziel gilt eine definierbare Lokalisierung dieser Proteine in allen drei
genannten Lebersystemen.

Unterpunkt 2.1: Generierung transgener Mäuse
Transgene Mäuse, die fluoreszierende Fusionsproteine von Rab4, Rab5, Rab7 und Rab11 exprimieren
werden am MPI-CBG kloniert und molekular auf ihre Integrität charakterisiert.

Unterpunkt 2.2: Bildgebende Lokalisierung von Rab- und Rab-Effektoren in Leberzellen
Die Rab- und Rab-Effektor Proteine werden in Leberdünnschnitten, Hepatozyten und Hepatozyten
Couplets lokalisiert. Dazu dient ein Spektrum spezifischer Antikörper. Als Zielvorgabe gilt hier die
bildgebende Lokalisierung und Verteilung dieser Proteine in Leberdünnschnitten Hepatozyten und
Hepatozyten Couplets von Wildtyp-Mäusen. Die Endosomen in Hepatozyten werden durch die
Internalisierung fluoreszierender Dextrane markiert.

Unterpunkt 2.3: Standardisierung der bildgebenden Analyse
In allen zellulären Lebersystemen wird für die Bilder fluoreszenzmarkierter Endosomen eine
quantifizierbare Analysemethode benötigt, die eine Co-Lokalisierung mit den fluoreszenzmarkierten
Proteinen des Endozytose-Wegs dokumentiert. Vorrangig werden hier die Rab-Domänen und die
räumliche Verteilung der Endozytose-Proteine relativ zu zellulären Fixpunkten, z.B. dem Zellkern
untersucht. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Analysen wird die relative Verteilung der Proteine innerhalb
der einzelnen Endosomen und die räumliche Verteilung der markierten Kompartimente sein.
Das BioMIP wird die theoretischen Parameter definieren, die für die Modellierung der
bildgebenden Daten benötigt werden und damit die Voraussetzung zur Etablierung der Algorithmen für
22
Projekt 3P3137 Systemology
die Bildanalyse schaffen. In diesem Stadium wird es die vorrangige Aufgabe der theoretischen Analyse
sein das Wissen um kinetische/ biophysikalische Vorgänge der Endozytose mit den Molekularen in-vivo
Daten zu verbinden. Ziel ist es eine parametaresierte Standardbeschreibung der Zelle der Art zu
formulieren, dass eine ausreichend verlässliche Darstellung von gemessenen Daten und StandardParametern erhalten wird und dass diese Parameter die vollständige Komplexität des Zellularen
Systems so gut wie möglich reflektieren. Evotec Technologies wird die Bildanalyse-Algorithmen zur
Extraktion von Daten aus den Bildern entwickeln.

Unterpunkt 2.4: Bildgebende Lokalisierung von Rab- und Rab-Effektoren in Leberzellen von transgener Mäuse
Die Rab- und Rab-Effektor Proteine werden in Leberdünnschnitten, Hepatozyten und Hepatozyten
Couplets von transgener Mäuse (AP2.1) lokalisiert.
Arbeitspaket 3: Definition der Endosomen-Dynamik
Der Fokus dieses Arbeitpakets ist die Definition der endosomalen Kompartimente mit Hilfe von
Fluorescenz-basierten optischen Assays. Der endozytotische Weg in tierischen Zellen internaliziert
sowohl Flüssigphasen- wie auch membrangebundene- Marker und dies erläubt die Verwendung von
assays, um die interne Zusammensetzung, Verteilung und Funktion von Endosomen zu bestimmen.
Dies beinhaltet die Messung des endosomalen pH-Wertes, die endosomale Motilität, das endosomale
Calcium, und die Fusion von Endosomen innerhalb lebender Zellen. Die Assays werden verwendet, um
den Gehalt und die Verteilung von Endosomen in primären Hepatozyten sowie die Kompartimente der
apicalen und basolateralen Transportwege in Hepatozyten-couplets zu bestimmen. Das Ziel beinhaltet:
Assay-Entwicklung
und
Anpassung
an
die
Opera-Hochdurchsatz-Imaging-Plattform
uber
Protokollautomation und Hochdurchsatz-Daten-Aquisition. Die Assays werden dann für ein Genomweites Screening im grossen Maßstab (AP 6) verwendet.

Unterpunkt 3.1: Endozytose Assays
Um Endozytose mit Hilfe der Opera-Plattform zu messen, warden fluorezierende Proteine (markiert mit
Fluorophoren, die mit 488/633nm angeregt werden können) in primärer Hepatozyten internaliziert. Ziel
ist hier ein Assay mit dem es möglich ist, während der Bildaquisition mit Opera Endozytoseprozesse an
einzelnen Zellen ‚real-time’ zu quantifizieren. Diese Assays sind die Voraussetzung, um die
Zellmarkierungs- und Imaging-bedingungen für die Automatizierung und das integrierte Modellieren zu
optimieren.
Die Internalizierung fluorescenzmarkierter Rezeptor-Liganden (Transferrin, EGF, LDL, IgA,
TGFbeta) wird in primären Hepatozyten dargestellt und quantifiziert, wobei die Internalisierungszeit und
Lokalisation der Marker die zu messenden Parameter sind. So werden Bilder erhalten, die die
Bewegung des Flüssigphasen-Transports und der Liganden innerhalb des endozytotischen systems
beschreiben und, was sehr wichtig ist, die Morphologie des endosomalen Wegs beschreiben. Diese
Assays werden anfänglich für das genomische Screening verwendet werden.

Unterpunkt 3.2: Bildanalyse von endosomalen Aufnahme-Assays
Die Bilder, die in 3.1 generiert wurden, benötigen Analyse-Algorithmen, die sowohl die räumliche
Verteilung als auch Endosomen-spezifische Werte für das Modellieren bereitstellen. Analytische
Verfahren werden getestet, um die morphologie und die Endozytoserate zu vergleichen. Als ein Beispiel,
23
Projekt 3P3137 Systemology
werden Bildanalysen in der Lage sein den Transport Rezeptor-gebundener Liganden im Rahmen des
Endosomen-Recyclings zu erkennen und zu quantifizieren.
Die Einzelheiten der Endosomendynamik sind unterhalb der Auflösungsgrenze der Bildgebung. Als
Konsequenz ist es erförderlich, dass die Theorie Mittel bereitsstellt, um eine Verbindung zwischen den
expertimentellen Daten und dem breiten Spektrum möglicher endosomaler Dynamik zu herzustellen.

Unterpunkt 3.3 : Endosomaler pH - Assay
Hier werden lösliche duale Wellenlängen-Indikatoren für den pH-Wert in Hepathozyten synthetisiert und
für endosomale pH-Messungen über in vivo
pH-Kalibrierung mit der Opera-Plattform getestet.
Bildanalysen verwerten die Verhältnisberechnungen für Hintergrund-korrigierte integrierte EndosomenIntensitätsmessungen im Vergleich mit einem Satz von Verhältnissen, die gegen den pH-Wert kalibriert
sind, bei beginn der Daten Akquisition somit können endosomale pH-Werte und räumliche Koordinaten
bestimmt werden.

Unterpunkt 3.4 : Endosomen – Fusions - Assay
Dieses Ziel umfaßt die Synthese des Fusions-Nachweisreagenzes (fluoreszierendes Avidin + ein
biotinnylierter Partner), um den Extinktions- und Emissionswellenlängen zu entsprechen, die für das
Opera-System geeignet sind. So werden die optimalen Fluorphore für ein gutes Signal : HintergrundVerhältnis identifiziert. Unter Verwendung von Flüssigphasen-Markern und Rezeptor-gebundenen
Liganden wie der Biotin- markierte Partner, werden Fusionsmessungen durchgeführt. Ziel ist es real
time-Messungen zu erlauben, die dann direkt für ein Hochdurchsatz- Screening von Endosomenfusion in
Anwesenheit von Substanzen oder RNAi-Bibliotheken (s. AP 5 & 6) verwendet werden können.
Langfristiges Ziel ist es dieses System mit der automatisierten 3D – Messtechnologie zu kombinieren,
die für das Opera-System entwickelt wird (s. AP7), um 3D ratiometrische Messungen und
Datenanalysen zu ermöglichen

Unterpunkt 3.5 : Endozytotische Recycling-Aassays und Transport über die rab Domänen
Mit Hilfe von fluoreszierenden Liganden werden über Rezeptor-Trafficking Internalisierung und
Wiedererscheinen der Marker auf der Zelloberfläche quantifiziert. Der Rab – Domänen – Transport –
Assay quantifiziert das erscheinen der Marker in verschiedenen Stadien des endozytotischen-/
Recycling-Weg, die rab4/rab11 GFP Fusionproteine enthalten.
Arbeitspaket 4: Entwicklung des Hepatozyten-couplet-Systems für Transcytose und polarisierte
Endozytose
Ziel ist die Entwicklung eines Hepatozyten-couplets-Systems für das Imaging und Messung von
Transcytose und Endozytose in einem polarisierten Zellsystem. Hepatozyten können aus der Leber als
einzelne Zellen oder Zellverbände mit vielen Zellen isoliert werden. In couplets sind zwei Zellen durch
eine apikale Vakuole miteinander verbunden die sich von den basolateralen Plasmamembran-domänen
unterscheidet. Kurzfristiges Ziel ist die Etablierung eines standartisierten Verfahrens für die Isolierung
von Hepatozyten-couplets aus Mausleber und das mittelfristige Ziel ist die Etablierung eines
störungsfreien Imgaging – basierten Assays für endozytotischen und transcytotischen Transport in
polarisierten Hepatozyten. Hepatozyten-couplets besitzen eine funktionelle und morphologiscge Polarität
ähnlich den Hepatozyten in situ und stellen ein Modellsystem für das Imgaing von Transcytose bereit.
24
Projekt 3P3137 Systemology
Die Polarität wird durch tight junctions bestimmt, die die apikale Vakuole verschließen, durch die
differenzielle Verteilung des Cytoskeletts und assoziierter Moleküle sowie den spezifischen VesikelTransport.
Die Technologiebasis für dieses Ziel sind Dielektrophoretisches Feld – basierte Chips, die von Evotec
Technologies entwickelt wurden. In diesem System werden Zellen in eine Mikro-Flüssigkeitskammer
injiziert, die auf einen Fluoreszenzmikroskop angebracht ist, wo sie eingefangen, sortiert, ausgerichtet
und gedreht werden können, wobei Feldstärken. verwendet werden, die von einem Elektrodenpaar
generiert werden, dass an der oberen und unteren Oberfläche der Kammer angebracht ist.Die zellen
können individuell perfundiert werden und Ziel ist die Entwicklung einer Kammer und eines
handhabbaren Systems zur apikalen und basolateralen Mikroperfusion des Hepatozyten-couplets mit
fluoreszierenden Proteinen und Rezeptor-Liganden. Die Technologie der Handhabung wird bewertet und
verfeinert um eine halbautomatische Analyse zu erlauben. Zusätzlich wird die Effizienz der coupletTransfektion / Infektion mit Standart-Plasmid-basierten-Transfektionsverfahren / Adenoviren bewertet
(AP 9)

Unterpunkt 4.1: Couplet-Markierung mit laminarer Strömung
Die Hepatozyten-couplets, die im Arbeitspaket I isoliert wurden, werden als Ausgangsmaterial für die
Entwicklung von Transzytose-Assays verwendet, wobei fluoreszierende Liganden oder FlüssigphaseMarker verwendet werden. Kurzfristiges Ziel ist ein Imaging des IgA-Transports hin zu der apikalen
Vakuole, langfristiges Ziel ist das simultane Imaging der Transzytose von beiden Plasmamembranen
aus. Di-elektrophoretisches Feld-basierte Chips werden für die Bearbeitung und das Imaging der Zellcouplets entwickelt. Laminare Strömungsverfahren werden für die Markierung der basolateralen
Oberflächen der Zellen etabliert.

Unterpunkt 4.2: Imaging von Transzytose in isolierten Hepatozyten-couplets
Liganden werden hinsichtlich apikaler nach basaler Transzytose und vice versa durchmustert.
Besondere Anstrengungen werden dabei hinsichtlich des Nachfolgenden unternommen: i)ImagingSysteme werden mit Zell-Handhabungs-Systemen gekoppelt, um eine real time-Beobachtung und
Quantifizierung
der
Transzytose
zu
ermöhlichen;
ii)
Couplets
werden
mit
Hilfe
adenoviraler/herkömmlicher Vektoren, die fluoreszierende Rezeptor-Fusionsproteine exprimieren, für
das Imaging des transzytotischen Transports, hinsichtlich Transfektions-/Infektions-Effizienz optimiert

Unterpunkt 4.3: Imaging von Transzytose in isolierten Hepatozyten-couplets aus transgenen Mauslinien, die
die Kompartiment-spezifischen rab 4, 5, 7 und 11 als fluoreszierende Fusions-Proteine exprimieren
Das Imaging von Transzytose erfolgt unter Verwendung von rab-Domänen als Kompartiment-spezifische
Marker.
Arbeitspaket 5: Anwendung des Hochdurchsatz-Assays und Daten-Akquisition
Für das Modellieren von Endozytose ist eine hohe Datendichte erforderlich, um die Integration der
individuellen Assay-Daten in ein räumlich aufgelöstes Modell der endosomen Funktion zu erlauben. Aus
diesem Grund erfolgt das Imaging des endozytotischen Wegs unter Verwendung der OperaHochdurchsatz-Plattform, mit der ein umfassender Datensatz der vorstehend detailliert aufgeführten
Assays erhalten wird. Dieser wird dann zur Bewertung von Manövern, die Endozytose stören oder von
Substanzen, die den endozytotischen Weg beeinflussen sollen (pharmakologische Substanzen,
25
Projekt 3P3137 Systemology
Arzneimittel, kleine Molekül-Wirkstoffe, Anti-Krebsmittel etc.) und für die Konstruktion des EndozytoseModells verwendet.

Hochdurchsatz-Assay-Validierung und Anwendung
Dieser Punkt erfordert eine Modifizierung der Assays dahingehend, dass sie für die Robotertechnik und
Imaging-Plattform geeignet sind, die durch das Opera-System unterstützt werden.
o
o
o
o
o
o

Assay-Automatisierung in einer Standard-Mikrotiterplatte (96, 384)
Validierung
Systemische Akquisition von Daten unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Assays
Etablierung einer umfassenden Definition endosomaler Eigenschaften
Akquisition von Daten für eine Serie internalisierter oder exprimierter Marker und deren Kopplung
an die zeitlichen Verläufe der Endosomenbildung
Export der analysierten Daten zu dem Modellierungspartner
Unterpunkt 5.1: Hochdurchsatz-Daten-Akquisition der endosomalen Dynamik
Die grundlegende experimentelle Variable für diese Assays ist die Internalisierungszeit oder die relative
Zeit der Internalisierung endosomaler Marker. Jeder der Assays aus AP 3 wird systematisch auf einem
hohen Niveau erhalten, wobei wir veranschlagen, dass jedes Experiment 10 000 analysierte Endosomen
pro Punkt benötigt. Aus diesem Grund werden die Assays erweitert, wenn sie optimiert sind. Es sollen
Hochdurchsatz-Ergebnisse in Bezug auf Endozytose, pH-Wert und Fusion bereitgestellt werden. Wir
halten dies für einen wichtigen Punkt für das RNAi-Genom-weite Screening in nachfolgendem
Arbeitspaket.
o
Akquisition von Daten für eine signifikante Anzahl von Endosomen (ungefähr 10 000) für jeden
Test und jeden Parameter. Jeder Test wird systematisch hinsichtlich definierter experimenteller
Eingriffe durchmustert, was Folgendes beinhaltet: Endozytosezeit; Zerstörung des Zytoskeletts;
Verwendung bekannter Chemikalien zur Modulation von Endozytose.
Die Daten-Standardisierung, die im Arbeitspaket 2 formuliert ist, wird an dieser Stelle eingesetzt und
verstärkt die statistische Signifikanz der erhaltenen Daten.
Arbeitspaket 6: Genomisches Screening nach Hepatozyten-spezifischen Endozytose-Wirkstoffen
unter Verwendung kleiner inhibitorischer RNAs
Die Sequenzierung des Mausgenoms erlaubt nun ein Genom-weites Screening nach Molekülen, die als
Wirkstoffe des Proteintransports und der Signaltransduktionswege fungieren. Im vorliegenden Antrag
werden wir ein Genom-weites Screening mit den vorstehend beschriebenen Hepatozyten-Modellen und
–Assays verbinden, wobei wir kleine inhibitorische RNA-Moleküle verwenden, um individuelle
Genexpression spezifisch abzuschalten (knock down). Die Hochdurchsatz-Screening-Einrichtung des
MPI-CBG hat das know how und die technische Kompetenz, um dieses Projekt zu unterstützen. Die
Einrichtung hat Zugang zu sowohl 1) chemisch synthetisierten RNAi-Bibliotheken als auch 2)
Bibliotheken von Endoribonuklease basierten kurzen eingreifenden RNA (esiRNA), sowohl für
menschliche Zellen als auch für Zellen der Maus. RNAi-Transfektion wird verwendet, um den
Hepatozyten die Bibliothek zu verabreichen. Dazu werden diese auf Screening-Platten von hoher Dichte
gezüchtet.
So werden Moleküle identifiziert, die notwendige Komponenten der Hepatozyten-spezifischen
endozytotischen Transportmaschinerie beeinflussen, und es kann eine Reihe von Modulatoren generiert
26
Projekt 3P3137 Systemology
werden, die für spezifische Veränderungen in Stadien des endozytotischen Wegs verwendet werden
können.

Unterpunkt 6.1: Etablierung des RNAi-Assays in Hepatozyten
Für das Ausschalten von Reportergenen in primären Hepatozyten werden standardisierte Protokolle
entwickelt und unter Verwendung der Tests, die in AP 3 entwickelt wurden, getestet. Die folgenden
Zielgene werden verwendet, um eine Überprüfung des Konzepts für die Screening-Assays
bereitzustellen:
o
o
o
o

Moleküle, die Endozytose blockieren: Dynamin, RN Tre (Rab5 GAP)
Moleküle, die für den Eintritt in frühe Endosomen erforderlich sind: EEA1, Rabenosyn-5, hVPS34
Moleküle, die für das Recycling erforderlich sind: Rabenosyn-5, Rme1, Rab4IP
Moleküle die für Transzytose erforderlich sind: Rab4, Rab11, Rab17
Unterpunkt 6.2: Bioinformatische funktionelle Erläuterung der Kandidaten-Gene
Es werden phylogenetische Analysen der bekannten rab 4-, 5-, 7- und 11-Wirkstoffe durchgeführt, um zu
bestimmen, welches Merkmal des endozytotischen Wegs sich während der Evolution von niedrigen zu
höheren Eukaryonten wo verändert hat. Um prüfbare Vorhersagen über die rab-Wirkfunktion zu
entwerfen, werden Sekundär- und Tertiär-Strukturvorhersagen miteinander verglichen. Ziel ist es,
gemeinsame Bindungsmotive dieser Proteine zu identifizieren, die den Erhalt der rab-Domäne
unterstützen. So wird eine bioinformatische ‚Pipeline’ etabliert, die eine automatische Bewertung der
Kandidaten erlaubt, die in dem RNAi-basierten Screening identifiziert wurden. Diesbezüglich werden
Kandidaten-Gene einer Reihe von Standard-Sequenzanalyse-tools unterzogen. Kandidaten werden
ausgewählt hinsichtlich ihrer
o
o
o
o
Homologie in einer Auswahl von Modellorganismen
Protein-Domänen
Putative biochemische Funktion, zelluläre Rolle und zelluläres Kompartiment mit Hilfe der Gene
Ontology-Datenbank
Vorhergesagte Sekundär- und Tertiär-Struktur.
Diese Daten erleichtern die Analyse des RNAi-Screenings und bilden die Grundlage weiterer Studien mit
den identifizierten Kandidaten.

Unterpunkt 6.3: Heraufsetzen der RNAi-Assays für das automatisierte Hochdurchsatz-Imaging
Für das Ausschalten von Reportergenen in primären Hepatozyten, unter Verwendung Biorobotertechnischer Handhabung gekoppelt mit Plattenformaten von hoher Dichte, werden standardisierte
Protokolle entwickelt
o
o
Die Endozytose-Assays werden in dieses Protokoll integriert
Die für das Screening verwendeten Assays beinhalten: Flüssigphasen-Endozytose, Rezeptorvermittelte Endozytose, cargo-trafficking über Rab-Domänen, Endosomenfusion
Das Grundprinzip ist zunächst nach der Flüssigphase und dann nach Rezeptor-vermittelter Endozytose
zu screenen. Jeder Faktor, der auf diesem Niveau Endozytose reduziert, wird vermerkt und auf der
nächsten Screening-Stufe ausgeschlossen. Unter Verwendung von Flüssigphase- und Rezeptorgebundenen Markern wird dann die Endosomenfusion durchmustert. Der Transport durch die RabDomänen ist der finale Assay.
27
Projekt 3P3137 Systemology

Unterpunkt 6.4: Hochdurchsatz-Datenakquisition
Die Assays, die in 3 und 5 entwickelt wurden, werden systematisch auf jedes target angewendet, das
anhand des RNAi-basierten Screenings, unter Verwendung der Hochdurchsatz-Imaging-Plattform und
des hochauflösenden couplet-Transzytose-Assays identifiziert wurde. Die erhaltenen Daten werden
dann zu dem Modellierungspartner exportiert und verarbeitet, um die Parameter näher zu definieren, die
verwendet werden, um den Endosomenweg zu modellieren.
Arbeitspaket 7: Entwicklung einer Technologie-Plattform für endozytotisches Modellieren
Die Plattform-Technologie in diesem Antrag umfaßt den ultrahoch aufgelösten confocalen Imaging
Reader (Opera) und ein Einzelzell-Handhabungssystem ( Cytocon 300) von Evotec Technologies GmbH
(Hamburg). Die Opera-Plattform ermögtlich das gleichzeitige Imaging von zwei fluoreszierenden
Signalen mit der zusätzlichen Möglichkeit des Nachweises einer dritten Fluorophore, in Serie. Der
endozytotische Weg ist ein kinetisch regulierter Transport von Kompartiment zu Kompartiment und tritt
sequenziell und Zeitabhängig hinsichtlich endozytotischer cargo – Moleküle auf. Um das gesamte
Potential des Opera- Gerätes auszuschöpfen, wird es mit einer Umgebungskammer ausgestattet, mit
der die Zellen unter Gewebekultur- Bedingungen gehalten werden können. Das Cytocon wird für die
couplet-Assays entwickelt.

Unterpunkt 7.1: Image- Analyse
Dieses Arbeitspaket unterstützt die Screening-Plattformen und Imaging-Assays während des gesamten
Verlaufes des Projekts mit dem Ziel real time-Analysen zu entwickeln. Datenaufbereitung, Erstellung von
Datenbanken und Datenkompression.

Unterpunkt 7.2: Entwicklung einer Umgebungskammer für das Opera
Diese wird derart entworfen, das sie Gewebekultur-Bedingungen auf der Zellplatte reproduzieren kann,
während mit dem Opera-Gerät Bilder akquiriert werden.

Unterpunkt 7.3: Entwicklung des 3D- und 4D- Imaging
Das 3D- Imaging über Z-Serien Akquisition wird zusammen mit der Analyse-Software in der OperaPlattform eingeschlossen. Nach erfolgreicher Demonstration der 3D Akquisition wird das 4D Imaging
entwickelt.
Arbeitspaket 8: Modellierung des Endozytose-Prozesses
Die
Modellierung
Systemmodellierung.
der
Endozytose
Konventionelle
ist
eine
große
Herausforderung
Modellierungsplattformen,
die
mit
für
einer
die
theoretische
großen
Anzahl
verschiedener Spezies umgehen können, müssen um die Bearbeitung räumlich heterogener Systeme
erweitert werden. Weiter entscheidend auf der Ebene von Endosomen sind lokale Fluktuationen in der
molekularen Zusammensetzung, welche ja typischerweise nur einige wenige Kopien wichtiger
Bioplolymere enthalten. Dies verlangt nach einer Beschreibung auf Einzelmolekülniveau. Die
Modellierungsplattform PRESS, welche in BioMIP entwickelt wurde, kann beide Aspekte effizient
behandeln. Es ergibt sich allerdings ein weiteres Problem: Der Endosomentransport ist ein dynamisches
Multiphasensystem, in welchem die Dynamik nicht einfach auf der Ebene einzelner molekularer
Prozesse
beschrieben
werden
kann,
sondern
28
wo
kollektive
biophysikalische
Prozesse
Projekt 3P3137 Systemology
Membranübergänge (z.B. Vesikelknospung und –fusion) durch spezifische Proteine moduliert werden.
Aus
der
chemischen
Perspektive,
ergibt
sich
daraus
eine
zusätzliche,
supramolekulare
Beschreibungsstufe, die im Modell enthalten sein muss. Das bedeutet, dass wir in hier eine
Modellierungsplattform errichten müssen, welche die Kopplung biochemischer Mechanismen mit
biophysikalisch fundierten Modellen der kollektiven Prozesse ermöglicht und damit die Beschreibung der
räumlich aufgelösten Struktur des Endosomentransports gestattet.
Das Vorgehen kann in zwei Modellierungsschritte aufgeteilt werden:
(1) Modellierung der molekularen Reaktionskinetik bei vorgegebener Membrandynamik.
(2) Modellierung der durch diese Reaktionen induzierten Membrandynamik (Transport, Knospung,
Fusion, Wachstum und Solvatisierung).
Im ersten Stadium werden geometrische Daten aus Bildserien gewonnen und auf ein
Standardkoordinatensystem, in der endgültigen Version für polare Hepatocyten) abgebildet. Das zweite
Stadium verlangt nach einem Verständnis des Zusammenhangs zwischen Membrandynamik und
biomolekularer Mechanismen. Das Ziel ist die Entwicklung einzelner Endosomen vorauszusagen; dies
jedoch verlangt die Bewältigung einer ganzen Reihe von Unteraufgaben:
(i)
(ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
(vii)
(viii)
(ix)

Standardisierung von Bilddaten in Bezug auf ein normalisiertes
Leberzellenkoordinatensystem.
Entwicklung einer diskretisierten Geometrieplattform um direkten und durch supramolekulare
Strukturen, im speziellen Endosomen, vermittelten Molekültransport zu modellieren.
Gewinnung grundlegender Übergangsraten durch Analyse von High-Througput-Imaging
Daten.
Aufbau eines integrierten, räumlich strukturierten, stochastischen Modells der Endozytose.
Detaillierte Modellierung des Rab5-Kerns des Endozytosis-Regulationsprozesses.
Verbindung des detaillierten mathematischen Modells mit dem Modell basierend auf diskreter
Geometrie.
Iterative Verbesserung des integrierten Modells basierend auf spezifischen molekularen
Daten aus den High-Throughput-Image Assays.
Entwicklung eines Protokolls zur automatisierten Gewinnung des Designs von Experimenten
zur Gewinnung der benötigten Daten.
Hochdurchsatz Simulation und Vorhersage der Entwicklung einzelner Endosomen unter
variablen chemischen und räumlichen Bedingungen.
Unterpunkt 8.1: Standardisierung von Bilddaten im Bezug auf ein normalisiertes Leberzellkoordinatensystem
Diese Aufgabe wird näher diskutiert unter AP 2.3 Hier wird es darum gehen, die theoretischen
Spezifikationen der Anforderungen und das Morphing der Bilder verschiedener Zellen anzugeben, um
daraus standardisierte Daten des Endosomtransportes zu gewinnen.

Unterpunkt 8.2: Diskretisierte Geometrie-Plattform zur Beschreibung des intrazellulären Molekültransportes
Um die morphologische Komplexität der Endosom – Prozessierung sinnvoll und effizient zu beschreiben,
brauchen wir ein lokal determiniertes, diskretisiertes Modell der Geometrie, welches aber in der Lage ist,
die morphologische Dynamik zu beschreiben. Dabei verwenden wir eine diskrete Geometrie, um die
lokale Komplexität der Membran- und Cytoskelettkonfigurationen zu beschränken. Dabei wird die
zelluläre
Struktur
beschrieben
durch
Volumen-
(z.B.
Cytoplasma),
Flächen-
(z.B.
Endosomemembranen) und Linien-Elemente (z.B. Cytoskelett) in Zusammenspiel mit einzelnen
Molekülen.
Komplexere
Strukturen
(z.B.
Endosomen)
werden
aufgebaut
aus
solchen
Grundbestandteilen. Die diskretisierte Geometrie erlaubt eine Vereinfachung der Übergangsraten der
stochastischen Dynamik. Der Prozess des Molekülaustausches zwischen diesen verschiedenen
geometrischen
Grundbestandteilen
wird
detailliert
29
modelliert.
Das
Endresultat
wird
eine
Projekt 3P3137 Systemology
Modellierungsplattform sein, welche basierend auf räumlich aufgelöster, stochstischer Kinetik die
Beschreibung geometrisch komplexer intrazellulärer Organellen gestattet.

Unterpunkt 8.3: Gewinnung grundlegender Übergangsraten der Endozytose aus High-Throughput-Imaging
Daten
Die Charakterisierung der Endozytose als ein stochastischer spatio-temporaler Prozess wird am
einfachsten auf dem Markov-Niveau der Übergangsraten beschrieben (mit einer klaren Verbindung zu
konventionellen Parametern wie z.B. Reaktionsraten und Transportkoeffizienten). Für die teilweise
kontinuierlichen supramolekularen Prozesse der Membranreorganisation und des Molekültransport
verlangt dies die Beschreibung der entsprechenden diskretisierten Zustände. Die Längenskala der
Diskretisierung liegt in diesem Projekt unterhalb der Auflösung eines Lichtmikroskops, aber in den
Begriffen der statistischen Mechanik eindeutig eher auf der mesoskopischen als auf der molekularen
Ebene. Der Modellierungsprozess wird Informationen aus verschiedenen Quellen kombinieren und
teilweise
auch
mit
biophysikalischen
Schätzungen
ergänzen
müssen.
Weiter
wird
der
Modellierungsprozess den Typ der zur Auswertung gelangenden Bilddaten spezifizieren müssen. Im
Speziellen wird die Gewinnung von dynamischen Trajektoriendaten aus großen Mengen von Bilddaten
von Bedeutung sein.

Unterpunkt 8.4: Aufbau eines integrierten stochastischen Modells der Endozytose
Die Konstruktion eines räumlich aufgelösten, stochastischen Modells der kinetischen Prozesse der
Endosomverarbeitung
in
Leberzellen
basiert
auf
den
oben
beschriebenen,
geometrischen
Grundelementen. Die Modellierung wird schwerpunktsmassig ein biophysikalisch begründetes,
vollständiges funktionales Modell auf der Ebene individueller Endosomen anstreben, welches auch
genetische Details der biomolekularen Zusammensetzung der Zelle wiedergeben kann. Die Parameter,
welche den Endosomtransport und –fusion beschreiben, werden in direkte Verbindung mit den ihnen
zugrundeliegenden biochemischen Prozessen gebracht. Die stochastische Kinetik einzelner Endosomen
wird in einem räumlich aufgelösten, funktionalen Modell der Wechselwirkung tausender Endosomen in
einer Leberzelle integriert. Das Modell sollte dabei die komplette dreidimensionale Struktur der Zelle,
inklusive des Cytoskleletts behandeln können.

Unterpunkt 8.5: Detaillierte Modellierung der Rab5 Domäne im Endozytoseregulationsprozess
Die mathematische Modellierung der Rab5-Domaene geschieht in Zusammenarbeit mit Prof. Andreas
Deutsch. Sobald die kinetischen Parameter der Rab5-Effektoren bestimmt sind, und wir Anhaltspunkte
gewonnen haben, ob und wie diese Moleküle in einer Rab5-PI3P-abhängigen Art mit künstlichen
Endosomen verwendet werden können, sind wir in der Lage, einen solchen Prozess mit Hilfe
biophysikalischer und mathematischer Methoden zu modellieren. Die Kompartimentierung der
Endosomen in Rab5-Domänen ist ein weiteres Beispiel für die Modularisierung eines biologischen
Systems. Die Information über die Affinität der Rab5-Effektoren, die Rekrutierung artifizieller
Membranen, ihre Halbwertszeit auf Endosomen, und ihre Konzentration in Abhängigkeit
von der
Endosomaktivität und –Motilität wird uns die Bestimmung der detaillierten Wirkungsmechanismen des
Rab5-Modules liefern. Die Bestimmung der Wechselwirkung zwischen gegebenen Rab5-Effektoren und
die Reaktion des Gesamtsystems auf Fluktuationen in der Konzentrationen seiner Komponenten wird
von besonderem Interesse sein. Damit werden wir nicht nur in der Lage sein, die Voraussagen des
30
Projekt 3P3137 Systemology
Modells zu testen, sondern auch neue Eigenschaften des Systems aufzudecken, zum Beispiel ob das
System zu Oszillationen fähig ist, welche wiederum den Transport und die Positionierung von
Organellen in der Zelle steuern könnten.
Zentrale Frage ist, welcher Mechanismus für die Entstehung und laterale Organisation der RabDomänen verantwortlich ist. Sowie die kinetischen Parameter der Rab5-Effektoren bestimmt sind und
klar geworden ist, dass sich diese Moleküle in einer Rab5-PI3P-abhängigen Weise auf künstlichen
Endosomen rekrutieren lassen, sind wir in der Lage, die molekularen Interaktionen mit Hilfe
biophysikalischer und mathematischer Methoden zu modellieren. Dabei spielt die Abschätzung bzw.
Messung von Wechselwirkungspotenzialen (elektrostatische plus van der Waals Potenziale) für die
Endosomen eine entscheidende Rolle. Abhängig vom Aktivierungsgrad (cytosolisch=deaktiviert versus
membrangebunden=aktiviert) sollte sich eine elektrostatische Ver-/Entmischung der Phospholipide
abhängig vom Aktivierungsgrad
der Proteine (z.B. Rab5) ergeben. Das System könnte damit
ortsabhängig auf Signale (z.B. durch Rezeptor, der in seiner Umgebung PIP2 in PIP3 umwandelt) durch
Domainbildung reagieren. Eine große Herausforderung wird in der Ermittlung der Parameterwerte
liegen.
Die Kompartmentalisierung des Endosoms in Rab-Domänen kann als weiteres Beispiel für ein
modulares System betrachtet werden. Informationen zu den Affinitäten der Rab5-Effektoren, ihrer
Rekrutierung auf künstlichen Membranen, ihre Halblebenszeit auf Endosomen und den Einfluss ihrer
Konzentration auf Endosomfusionierung und -bewegung sollte es uns ermöglichen, im Detail
aufzuklären, wie das Rab5-Modul arbeitet. Es wird insbesondere auch interessant sein zu klären, ob und
wie die Aktivität eines gegebenen Rab5-Effektors andere beeinflusst und die Reaktion des Systems auf
Fluktuationen in den Konzentrationen seiner Komponenten zu ermitteln. Dies wird es uns nicht nur
ermöglichen, Modellvorhersagen zu testen, sondern auch neue Systemeigenschaften zu entdecken.
Z.B. besteht die Frage, ob das System Oszillationen generieren kaann, die die Kinetik von Transport und
Organellenposition innerhalb der Zelle regulieren.

Unterpunkt 8.6: Verbindung der detaillierten mathematischen Modelle mit dem integrierten, geometrisch
diskretisierten Modell
Das Testen der Kompatibilität der integrierten Modellierungsplattform mit den verifizierten Voraussagen
der
detaillierten
Modelle
von
Subprozessen
ist
eine
zentrale
Komponente
unserer
Modellentwicklungsstrategie. Sehr gut charakterisierte Teilprozesse, wie zum Beispiel die Diffusion von
Molekülen werden entscheidend für das Zusammenfügen der einzelnen Modellierungsebenen sein.

Unterpunkt 8.7: Iterative Verbesserung des integrierten Modells basierend auf spezifischen molekularen Daten
aus den High-Throughput-Image Assays.
Ergebnisse, gewonnen aus Scanning-Daten (Evotec+IMB)
und Daten des Molekül-Trackers
(BioMIP+IMB) werden mit den Voraussagen des Modells verglichen. Die Verbindung dieses Modells mit
der bearbeiteten High –Throughput - Image Datenbank ergibt zeitlich und räumlich aufgelöste EndosomBewegungsdaten relativ zu Struktureigenschaften der Zelle. Das Modell ergibt dann parametrisierte
Endosomverarbeitungscharakteristiken und simuliert die Funktion einer breiten Palette verschiedener
Protein-Expressions-Muster für Zellen unter verschiedenen Bedingungen und aus verschiedenen
31
Projekt 3P3137 Systemology
Zelllinien. Die Modellierungsplattform wird Web-basiert mit den Resultaten anderer systembiologischer
Leberzell-Projekte verbunden werden.

Unterpunkt 8.8: Entwicklung eines Protokolls zur automatisierten Gewinnung des Designs von Experimenten
zur Gewinnung der benötigten Daten
Die Automatisierung des Experimentendesigns zur optimalen Gewinnung der für die Vollendung des
integrierten Modells nötigen Daten ist natürlich eine große Herausforderung. Im Rahmen dieses Projekts
wird die Auswahl der Fluoreszenzsonden, der Variation der Parameter der Assays und der
Hochdurchsatz -Image Sampling Strategien aus einer kombinatorisch reichen Menge von Möglichkeiten
eine immer weitreichendere Automatisierung erfordern. Automatisierung bedingt zuerst die Erfassung
der
möglichen
Parameterbereiche
und
gegen
Ende
des
Projektes
vielleicht
sogar
eine
Rückkoppelungsstrategie zur effizienten Fokussierung der Experimente auf die relevanten Bereiche des
Parameterraumes.

Unterpunkt 8.9: Hochdurchsatz Simulation und Vorhersage der Entwicklung einzelner Endosomen unter
variablen chemischen und räumlichen Bedingungen.
Die Simulation der Endozytose wird in verschiedenen Stufen der Integration und Allgemeinheit der
äußeren (experimentellen) Bedingungen voranschreiten. Dies beinhaltet notwendigerweise einen
steigenden Bedarf an Rechenkraft. Die in diesem Projekt verfolgte Strategie beinhaltet die Verwendung
einfach zugänglicher Computerressourcen und das Schreiben von zugehöriger Software, die in der Lage
ist, den Anforderungen einer High-Throughput-Analyse gerecht zu werden. Es ist nicht das Ziel, während
dieses Projekts Hardware – Ressourcen, die zur Bewältigung ausgedehnter Analyse-Durchläufe nötig
wären, zu beschaffen.
Arbeitspaket 9: Endozytose-abhängiges TGF--Rezeptor-trafficking und Signaltransduktion
Ziel ist es den TGF--Signalweg als ein Modell zum Verständnis der Beziehung zwischen
endozytotischem Rezeptortransport und spezifischer Signaltransduktion in Hepatozyten zu verwenden.
Es werden fluoreszenz-markierte Fusionsproteine für die TGF--Rezeptoren und die assoziierten
Mediatoren, die die Rezeptoraktivierung mit der Signaltransduktion koppeln, generiert. Diese werden als
Werkzeuge verwendet, um die endozytotischen Signalwege der Rezeptoren und die Kompartimente zu
identifizieren, von denen die Signaltransduktion initiiert oder unterbrochen wird. Dabei wird die Dynamic
des endozytotischen Rezeptor-traffics in Abhängigkeit von Ligandenaktivierung, Signalisierung und
Antagonisierung in ein Endozytosemodell integriert. Mit Hilfe eines RNAi basierten screenings sollen
Faktoren identifiziert werden, die das Endozytose-abhängige TGF--Rezeptor-signalling beeinflussen.
Dieses Ziel wird ein Modell für eine Rezeptor-vermittelte Signaltransduktion bereitstellen, die die
räumliche Anordnung von Endosomen berücksichtigt.

Unterpunkt
9.1
TGF--signalling-abhängige
und
signalling-unabhängige
Rezeptor
(TRI,
TRII)-
Internalisierung in Hepatozyten.
Entwicklung des Assay für die Rezeptor-Endozytose.
Herstellung von Expressionsvektoren für fluoreszierende Fusionsproteine des TGF--Signalwegs
(Adenovirale Expressionsvektoren, living colors-Serie der Firma ClonTech; alternativ, NukleofectionTMTechnologie und Verwendung normaler Expressionsplasmide). Geplante Konstrukte: (TRI-EGFP,
32
Projekt 3P3137 Systemology
TRII-EGFP, Ds-red 1-Smad2, 3, 4, 7, oder Ds-red Smurf2; Evaluation der Konstrukte durch Expression
in Hepatozyten und nachfolgende Charakterisierung der TGF--Signaltransduktion (e. g. SmadPhosphorylierung im Western blot, TGF--Reportergen-Aktivierung).
Zur Entwicklung des Assays werden die Zellen mit TGF- stimuliert und die TGF--abhängige und die
TGF--unabhängige Mobilität der Rezeptoren Typ I und Typ II wird bestimmt. Der Endozytoseprozeß
wird dabei durch die Endozytose-Aufnahmetests dargestellt, die in AP 3 entwickelt wurden. Des
Weiteren wird bestimmt, ob ein basolaterales Sortieren der Rezeptoren und eine nachfolgende
gerichtete Signaltransduktion in Hepatozyten-couplets erfolgt. Dargestellt wird die Verteilung der
Rezeptoren im endozytotischen Prozeß in Abhängigkeit von Ligandenbindung.

Unterpunkt 9.2 Assays für die Endozytose-abhängigen Rezeptor/Smad-Signalosom-Formierung und
Degradation.
Nachweis
Liganden-abhängiger
Rezeptor-Aktivierung
und
Smad-Phosphorylierung
durch
Co-
Lokalisationsexperimente (Smad-Rekrutierung an die endosomale-Membran, Aktivierung und nukleäre
Translokation).
Ziel ist die Bestimmung des/der endosomalen Kompartiment(s)(e), in denen die downstreamMediatoren Smads 2 & 3 an den aktivierten Rezeptorkomplex binden und das Signal in den Zellkern
weiterleiten. Die Rekrutierung der fluoreszierenden Smads 2 & 3 in die endosomalen Kompartimente
werden entweder durch die Internalisierung von Flüssigphasen-Fluoreszenzmarkern (wie in AP 3) oder
durch Rezeptor-gebundenes fluoreszierendes TGF- nachgewiesen (Aufnahmezeitfenster).
Die Degradation des Ligand-Rezeptorkomplexes erfolgt unter Verwendung eines negativen
Rückkopplungsmechanismus
über
Smad7/Smurf2.
Smad7/Smurf2
bindet
an
den
aktivierten
Rezeptorkomplex mit höherer Affinität als die Signalmediatoren Smad2 & 3. In der Folge wird der
Rezeptorkomplex über einen Endozytose-Mechanismus für proteosomalen Degradation bereitgestellt.
Ziel ist es den endozytotischen Signalweg darzustellen, der an diesem Prozeß beteiligt ist. Dazu erfolgt
die ektopische Expression eines fluoreszierenden Smad7/Smurf1-Komplexes und die in AP3 und
Anwendung 1 beschriebenen Endozytose-Assays werden verwendet, um die genaue Lokalisation der
Endozytose-abhängigen Rezeptordegradation zu verfolgen.

Unterpunkt 9.3 TGF--Rezeptorlokalisation und –Internalisierung in Hepatozyten und Hepatozyten-couplets
aus GFP-rab transgenen Mäusen
Die in den Anwendungen 9.1 und 9.2 beschriebenen Untersuchungen werden mit Hepatozyten und
Hepatozyten-couplets aus den in AP 2 beschriebenen transgenen Mauslinien rab 4, 5, 7, and 11
durchgeführt, um die Bedeutung der verschiedenen rabs für des Rezeptorkomplex-trafficking zu
bestimmen.

Unterpunkt 9.4 Modellierung der Rezeptorkomplex-Endozytoseprozeße bei Verwendung verschiedener
Liganden aus der TGF--Familie.
Die verschiedenen Liganden der TGF--Superfamilie, die unter Verwendung der Smads 2 & 3
signalisieren sollen hinsichtlich des endozytotischen Rezeptorkomplex-trafficks untersucht werden. Es
handelt sich um die Liganden TGF-1, TGF-2, TGF-3, die Activine A, B, C und E, Nodal und GDF8/Myostatin. Die Assays, die in den Anwendungen 9.1, 9.2 und 9.3 beschrieben sind, werden verwendet,
33
Projekt 3P3137 Systemology
um die Liganden-abhängigen unterschiedlichen zellulären Antworten mit Veränderungen des
Rezeptorkomplex-Transportes zu assoziieren. Nach initialen Einzelexperimenten zur Validierung des
Systems werden die Assays in Hochdurchsatzverfahren (AP 5) zur Bereitstellung von Daten für das
Modellieren (AP 8) durchgeführt. Das System kann gegebenenfalls um die Gruppe der BMP-Liganden
erweitert werden, die in einer Gruppe von etwa 20 verschiedenen Mitgliedern ebenfalls zur TGF-Großfamilie gehören, die im Gegensatz zu den vorstehend erwähnten TGF-/Activin-Liganden die
Smads 1, 5 und 8 als Signalmediatoren verwenden. Ein weiterer Untersuchungsaspekt ist
unterschiedliche Konzentrationen einzelner Liganden hinsichtlich ihrer Wirkung auf Rezeptor-traffick und
Signaltransduktion vergleichend zu charakterisieren, da bekannt ist, daß diese verschiedenen zelluläre
Antworten hervorrufen können.

Unterpunkt 9.5 RNAi-Screening zur Identifizierung von Faktoren, die das TGF--Signaltransduktions-System
beeinflußen.
Es sollen in diesem Assay Faktoren bzw Translation inhibierende RNAs identifiziert werden, die die
TGF--Signaltransduktions-abhängige
bzw.
Smurf2/Smad7-Rezeptor-Degradations-abhängige
Endozytose und die damit verbundenen zellulären Antworten hinsichtlich des TGF--Rezeptor-turnover
sowie in Bezug auf Intensität und Richtung der Signaltransduktion beeinflußen.
Arbeitspaket 10: Projektmanagement und Anbindung an die Zellbiologie Plattform

Management
Der Koordinator wird die angestrebte Netzwerk Strategie folgendermaßen implementieren:
Meetings. Bei gesicherter Finanzierung, wird der Koordinator unverzüglich ein Planungsmeeting zur
genauen Abstimmung der Zusammenarbeit und zur Festlegung der experimentellen Strategie in
Kooperation mit den Netzwerk Partnern organisieren. Weiterhin sind monatliche Meetings der
Projektleiter, sowie vierteljährliche Meetings der Projektbeteiligten im Jahr 1 geplant. Über den restlichen
Projektzeitraum werden sich die Projektleiter alle zwei Monate und die Projektbeteiligten halbjährlich
treffen.
Besuche. Das Projekt wird unverzüglich in Angriff genommen, pro Arbeitsgruppe wird jeweils
mindestens eine Person (Doktoranden oder PostDocs) am beschriebenen Projekt arbeiten.
Selbstverständlich werden die benötigten Reagenzien und Methoden geteilt und weitergegeben. Vor
allem in der Anfangsphase kommt dem schnellen Transfer von Know-How und Technologie, auch durch
den Austausch von Mitarbeitern eine besondere Bedeutung zu.
Kommunikation.
Alle
Beteiligten
des
Netzwerks
benutzen
regelmäßig
elektronische
Kommunikationsmöglichkeiten (z.B Email) und daher können wichtige Informationen schnell
weitergegeben werden.
Weitergabe der Ergebnisse. Die Verbreitung unserer Erkenntnisse in der wissenschaftlichen
Gemeinschaft soll über die etablierten Wege stattfinden: Kommunikation bei Meetings und Konferenzen
und Publikationen in wissenschaftlichen Zeitschriften. Es soll sichergestellt werden, daß junge
Wissenschaftler, die an diesen Forschungen teilnehmen aktiv an internationalen Meetings teilnehmen.
34
Projekt 3P3137 Systemology

Anbindung an die Zellbiologie-Plattform
Die im Rahmen der Zellbiologie-Plattform bereits verfügbare Technologie besteht aus HepatozytenZellreaktoren, die die Organisation des Organs in vivo nachbilden. Ein Ziel dieses Projektes ist die
Anpassung und Verbesserung der für dieses System entwickelten Protokolle mit Hilfe von im Rahmen
des Projektes generierten Daten.
Dieser Teil des Projektes soll über den ganzen Zeitraum des
Vorhabens laufen, und Schnittstellen zwischen der Zellbiologie und der Systembiologie-Plattform
ermöglichen.
Denkbare Schnittstellen in diesem Projekt wären:
o
Standardisierung von Zellmodellen durch Proteinlokalisation
o
Bestimmung der Verteilung von Proteinen mit Hilfe von Hepatozyten und anderen Zellen aus
transgenen Tieren oder Immunofloureszenzmarkierung,
die an der Regulation von
endozytotischen Transportvorgänge in Zellkultursystemen beteiligt sind
o
Auswahl und Entwicklung von Zellkultursystemen für Hochdurchsatz-Bildgebungsverfahren.
o
Identifikation und Anpassung von Zellmodellen für Genom-umfassendes Screening.
o
Bereitstellung von Bildgebung und durch Bildgebung erfaßte Daten zur Intergation in die
übergreifenden Modeling-Plattform in diesem Projekt.
o
Entwicklung von Protokollen zur Markierung und Darstellung endozytotischer Kompartimente.
o
Zugriff auf Bildgebungssysteme innerhalb des Projektverbundes für Experimente von Partnern
aus dem übergreifenden Finanzierungsprogramm
35
Projekt 3P3137 Systemology
ZEITACHSE
Arbeitspaket
Jahr 1
Q1
Q2
Jahr 2
Q3
Q4
Q1
Q2
Q3
Jahr 3
Q4
Q1
Q2
Arbeitspaket 1
1.1 Isolierung von Hepatozyten /
Markerevaluierung:
1.2; 1.3 Hepatozyte Zell Imaging
platform:Fluoreszenzbildgebung
ICCP
IMB
1.4 Handhabung von Hepatozyten
Couplets
IMB EVOTEC
Arbeitspaket 2
2.1 Generierung transgener Mäuse
2.2 Bildgebende Lokalisierung von
Rabund
Rab-Effektoren
in
Leberzellen
2.3 Standardisierung der
bildgebenden Analyse
2.4 Bildgebende Lokalisierung von
Rabund
Rab-Effektoren
in
transgener Mäuse Leber
MPI CBG
MPI CBG IMB
EVOTEC
BIOMIP
MPI CBG
IMB
Arbeitspaket 3
3.1 Endozytose Assays
3.2 Bildanalyse von endosomalen
Aufnahme-Assays
3.3 Endosomaler pH
3.4 Endosomaler Fusion
3.5 Endosomaler Recycling & rab
Assay
IMB
BIOMIP Evotec
IMB
IMB
MPI CBG
Arbeitspaket 4
4.1 Couplet-Markierung mit
laminarer Strömung
4.2 Imaging von Transzytose
4.3 Imaging von Transzytose
(transgener Zellen)
IMB
IMB
MPI
CBG
Arbeitspaket 5
5.1. Hochdurchsatz-DatenAkquisition der endosomalen
Dynamik
MPI
CBG
IMB
Endozytotische Aufnahme
Endosomaler fusion
Endosomaler Recycling & rab
assay
IMB
MPI CBG
IMB
Arbeitspaket 6
MPI
CBG
6.1 Etablierung des RNAi-Assays
6.2 Bioinformatics
6.3 RNAi Screening
Endozytotische Aufnahme
Endosomaler fusion
Endosomaler Recycling & rab
assay
Reiteration
Task 6.4: Hochdurschsatz Daten
Akquisition
MPI CBG (Habermann)
IMB
IMB
MPI CBG
IMB MPI CBG
36
Q3
Q4
Projekt 3P3137 Systemology
Jahr 1
Task
Q1
Q2
Jahr 2
Q3
Q4
Q1
Q2
Jahr 3
Q3
Q4
Q1
Q2
Q3
Q4
Arbeitspaket 7
7.1 Image- Analyse
7.2 Umgebungskammer für das
Opera
7.3 3D- und 4D- Imaging
EVOTEC
EVOTEC
EVOTEC
Arbeitspaket 8
8.1
Grundlage
für
die
Standardisierung der Bilddaten
8.2
Diskretisierte
GeometriePlattform
8.3 Gewinnung der fundamentalen
Daten
8.4 Aufbau des integrierten Modells
8.5 Detailliertes Modell des Rab5 –
Kerns
8.6 Modelleinbettung
8.7 Iterative Verbesserung
8.8 Automatisiertes Design von
Experimenten
8.9 HochdurchsatzVoraussagen
BIOMIP
BIOMIP
BIOMIP
BIOMIP
TU Dresden (Deutsch)
BIOMIP TU Dresden
BIOMIP IMB TU Dresden
BIOMIP IMB TU Dresden
BIOMIP IMB TU Dresden
Arbeitspaket 9
9.1 Molekulare Biologie
9.1TGF--Rezeptor Internalisierung
Assay
9.2
Rezeptor/Smad-SignalosomFormierung und Degradation Assay
9.3 TGF--Rezeptorlokalisation und
–Internalisierung in Hepatozyten
und Hepatozyten-couplets aus
GFP-rab transgenen Mäusen
9.4 Modellierung der Rezeptor
komplex Endozytoseprozeße
9.5 RNAi screening
ICCP
IMB
ICCP IMB
ICCP IMB
ICCP IMB
IMB
Arbeitsplan-Matrix
ICCP
IMB
MPICBG
BIOMIP
Evotec
AP1
AP2
AP3
AP4
AP5
AP6
AP7
AP8
AP9
36
3
9
21
9
15
15
6
12
3
6
9
3
3
3
3
6
18
18

54
90
MPI CBG
TU
Habermann Dresden
36
24
78
36
36
84
36
 MM
36

42
21
42
12
21
60
24
114
36
36
372
( MM= Man Monate)
37
Projekt 3P3137 Systemology
MEILENSTEINE
Time (monat)
1
6
12
15
18
22.5
24
37
30
33
36
Milestone
Systemology Projektkoordinations Meeting (AP 10)
Endozytose Assay etabliert (AP3.1) Grundlage für die Standardisierung der Bilddaten
etabliert (AP8.1)
HT Endozytose Imaging erste Daten (AP3); TGFb Rezeptor Internlisierung Assay
etabliert (AP9.2)
Transgener Mäuse vorhanden (AP2.1) Endosomaler Fusion &pH Assays etabliert (AP
3.3,3.4) Geometrie-Plattform etabliert (AP8.2)
Bildgebene Lokalization etabliert (AP2.2, 2.3, 2.4)
Hochdurchsatz Akquisition etabliert (AP5)
Imaging von Transzytose etabliert (AP4.3)
Integriertes Modell etabliert (AP8.4)
RNAi Screening etabliert (AP6.3)
Erste Hochdurchsatz Voraussagen (AP8.9)
Model Bewertung. Projektreport
Finanzplan
Evotec Technologies (ET)
Jahr 1
Personalkosten
36 man-months
Software subcontract
Verbrauchsmaterial
Reisekosten
Plattform reisekosten

Gesamtsumme
Beantragte Summe (45%)
Jahr 2
Jahr 3

120000
120000
120000
360000
40000
15000
4000
750
179750
0
15000
4000
750
139750
0
15000
4000
750
139750
40000
45000
12000
2550
459550
207000
RWTH institute for Molecular Biotechnology (IMB)
Jahr 1
Jahr 2
Jahr 3

Personalkosten BATIIa
57640
58823
59991
176454
36 months
28820
29411.5
29995.5
88227
BATIIa 18 months
37617
38367
39141
115125
BATVIa/b 36 months
30000
32000
30000
92000
Verbrauchsmaterial
Reisekosten
2000
2000
2000
6000
750
750
750
2250
Platform Reisekosten

156827 161351.5 161877.5
Requested sum (100%)
480056
Cost of consumables for development of assays for
1. measuring endocytic trafficking of receptors in hepatocytes and the modulator roles of
Rab effectors and other components of the endocytic machinery- fluorophores, proteins,
coupling reagents, protein purification, dextrans (AP 2 – 5) 2. measurements of kinetics
endocytosis, endosome pH endosome fusion (AP 3) 3. genomic RNAi screening (AP 6)
4. Molecular Biology consumables and enzymes (AP 9)
2.
Institute of Clinical Chemistry and Pathobiochemistry at the RWTH University Hospital (ICCP)
Jahr 1
Jahr 2
Jahr 3

Personalkosten
BATIIa 18 months
28820
29411.5
29995.5
88227
37617
38367
39141
115125
BATVIa/b 36 months
Verbrauchsmaterial
15000
15000
15000
45000
38
Projekt 3P3137 Systemology
Reisekosten

Requested sum (100%)
1500
82937
1500
84278.5
1500
85636.5
4500
252852
Cost of consumables for development of assays for
1. Hepatocyte and Hepatocyte couplet isolation, culture and shipping – animal housing facility, enzymes,
cell culture media (AP 1)
2. Cloning and expression of fluorescent fusion proteins – enzymes, plastic ware, molecular biology
reagents (Aim 9)
Fraunhofer Institute for Molecular Biology (IME – RWTH Aachen campus)
Jahr 1
Jahr 2
Jahr 3

Opera, Cytocon ,
Biorobotics operating
costs, service contracts,
23000
23000
24000
70000
biorobotics service
costs, replacement
parts, DNA sequencing
Verbrauchsmaterial
10000
10000
10000
30000
33000
33000
34000

Requested sum (100%)
100000
Cost of consumables for development of assays for
1. Endozytose Assays on the Opera platform- consumables, tips, disposable plastic ware, automated
cell handling (AP3, AP5). 2 measurements of Transcytosis in Hepatocyte couplets on the cytocon–
sheath and perfusion buffers, filters, Medien (AP1,4). 3 genomic RNAi screening (AP6). 4. Construct
sequencing (AP9)
Prof. Dr J. McCaskill Fraunhofer Research Unit BioMIP
Jahr 1
Jahr 2
Jahr 3
Total
Personal (BAT IIa /1b)
84(48+36) Mann-Mon.
Geräte (Rechner)
Verbrauchsmittel
Reisemittel
Gesamtsumme
298922
304853
252660
856436
10000
0
0
10000
15000
18500
10000
43500
3000
4000
3000
10000
326922
327353
265660
919936
Beantragte Summe (50%)
459968
Prof. Dr M Zerial Max Planck Institute for Cell Biology and Genetics (MPI CBG)
Jahr 1
Jahr 2
Jahr 3
Personalkosten
36 man-months
14000
14000
14000
42000
Reisemittel
2500
2500
2500
7500
Consumables 1
10000
10000
10000
30000
Consumables 2
10000
10000
10000
30000
Consumables 3
150000
39500
0
189500
186500
76000
36500

Beantragte Summe (100%)
299000
Cost of consumables for development of assays for
1 measuring endocytic trafficking of receptors in hepatocytes and the modulator roles of Rab effectors
and other components of the endocytic machinery (Specific Aim 2 – 5). 2 measurements of kinetics of
Rab5 effector recruitment and activity on early endosomes necessary for the mathematical modeling and
simulation of the Rab5 domain (Aim 8). 3 genomic RNAi screening (Aim 6)
39
Projekt 3P3137 Systemology
Bianca Habermann Max Planck Institute for Cell Biology and Genetics (MPI CBG)
Jahr
Jahr 2
Jahr 3
1
Personalkosten
36 man-months
14000
14000
14000
42000
Reisekosten
2500
2500
2500
7500
Equipment
5000
0
0
5000
21500
16500
16500

Beantragte Summe (100%)
54500
Andreas Deutsch TU Dresden
Jahr
Jahr 2
Jahr 3
1
Personalkosten
36 man-months
45000
45000
45000
Travel and Conference
2500
2500
2500
fees
Equipment
4000
0
0
51500
47500
47500

Beantragte Summe (100%)
135000
7500
4000
146500
Budget summary
Evotec Technologies
IMB
ICCP
IME
MPICBG
MPICBG Habermann
TU Dresden
BioMIP
 Jahr 1- 3
207000
480056
252852
100000
299000
54500
146500
459968
Beantragte Summe
1999876
IV. Verwertungsplan
Inhalt dieses Antrags ist es, bewährte Technologien zu verwenden um ein wissenschaftlich
anspruchsvolles Ziel zu erreichen – die Modellierung der Endozytose und Klärung der RezeptorFunktion bei intakten, lebenden Hepatozyten. Das Erreichen dieses Projektziels wird durch die
gemeinsame Expertise des Konsortiums sichergestellt. Die Funktionalität jeder einzelnen, in diesem
Antrag aufgeführten Technologien wurde bereits beschrieben, allerdings hat noch niemand versucht sie
in einem Ansatz zu vereinigen und ein neues biologisches System zu kreieren. Mit Hilfe dieses Systems
sehen wir uns in der Lage eine Hepatozyten-gekoppelte Analysemethode zu entwickeln, die nach
unserem Wissen einzigartig in ihrer Leistungsfähigkeit wäre.
Mit der Unterstützung von Evotec Technologies sollte es uns gelingen ein neues biologisches
Modelsystem zu entwickeln, dass sich ohne Probleme in das durch ihre Förderinitiative zu entwickelnde
Gesamtsystem integriert lässt. Dieses Modelsystem würde der nationalen und europaweiten Forschung
sowie kommenden Gemeinschaften der Systembiologie den Zugang zu technologisch adaptierbaren
und leistungsstarken Analysemethoden ermöglichen, welche dann auf hohem zellbiologischen Level
40
Projekt 3P3137 Systemology
Anwendung fänden. Diese Technologie könnte Deutschland an die Spitze der biologischen Modellierung
von Hepatozyten bringen und ein hohes ökonomisches und wissenschaftliches Potential schaffen.
Medizinische Relevanz
Die endozytotische Aufnahme ist aus verschiedenen Gründen von fundamentalem Interesse in der
medizinischen Forschnung.
Erstens ist sie anerkannt als primärer Aufnahmemechanismus für
therapeutische Proteine in Zellen und spielt zudem eine Schlüsselrolle bei der Aufnahme von
Rezeptormolekülen, die bereits als „Targets“
bei der medikamentösen Behandlung dienen. Die
endozytotische Aufnahme oder ihre Fehlfunktion sind in direkt Zusammenhang mit vielen chronischen
und akuten Erkrankheiten zu bringen, einschließlich Alzheimer, Choroidaemie und Herzerkrankungen.
Trotz alledem sind die Auswirkungen einer Fehlfunktion des endozytotischen Transports auf die
Zellphysiologie nur unzureichend erforscht und das obwohl beispielsweise belegt ist, dass Zytische
Fibrose durch die veränderte Fusion von Endosomen verursacht wird und nur wenig Informationen über
die Auswirkung einer Fehlfunktion der Endozytose bei Organen mit polarisierten Epithelzellen wie der
Leber vorliegen. Somit sollte man sich die Frage stellen, ob eine Fehlfunktion der endozytotischen
Aufnahme einen Einfluß auf die zellulare Struktur hat und als Konsequenz auf die Funktion dieser
Organe. Zudem ist es wichtig die Rolle der Rab Domäne in diesem molekularen Zusammenhang zu
klären, aber auch ihre Rolle beim Aufbau und der Organisation von polarisierten Zellsystemen. Der
bereits bekannte Zusammenhang zwischen Endozytose und humanen Erkrankungen sollte ausreichen
um das Interesse der pharmazeutischen Industrie an der Identifikation von Zielmolekülen für die
medizinische Therapie von humanen Funktionsstörungen zu wecken.
Wirtschaftliche Erfolgsaussichten
Das Marktpotential eines automatisierten mikroskopischen Systems ist schwer einzuschätzen da es bis
heute kein System auf dem Markt gibt, dass manuelle Mikroskope ersetzt kann. Berücksichtigt man die
Vorteile dieses Systems, welche Zellkulturen, Temperaturkontrolle und eine durchdachte Software
beeinhalten, so sind wir der festen Überzeugung, dass es eine hohe Akzeptanz für die Software, die
Hardware und die annotierte Proteom-Datenbank auf dem Markt geben wird. Die Bewertung des
Einflusses von Wirkstoffen auf Änderungen im zellulären Metabolismus ist ein anerkanntes Teilgebiet
der Arzneimittelforschung und Prozess-Bewertung. Da fast jede pharmazeutische Verbindung in der
Leber metabolisiert wird, gibt es ein besonderes Interesse die genetische Individualität sowie die
Unterschiede des Proteoms der Hepatozyten auf molekularer Ebene zu verstehen. Die hier entwickelte
Software und Datenbank stellt ein leistungsstarkes Instrument zur Detektion von Veränderungen des
Metabolismus auf der Ebene der Proteinverteilung, des Proteinnetzwerk und der Proteinfunktion dar.
Den Markt für das komplette System inklusive der mikroskopischen Plattform, der biologischen Tests,
der Software und der Datenbank stellt sowohl das Gesundheitswesen als auch die pharmazeutische und
biotechnologische Industrie dar.
Gegenwärtig wächst der Markt für biologische Hochdurchsatzsysteme jährlich um 15% und mehr. Der
Marktwert erstreckt sich zwischen 50 und bis zu 500 M€ für spezifische Geräte, wie zum Beispiel
Gensequenzierer, die es bereits gibt. Cellomics (USA), die ein Produkt auf dem Markt haben, das dem
bildgebende System ähnelt, das im Rahmen diese Projekts entwickelt werden soll, geben einen
41
Projekt 3P3137 Systemology
Zuwachs von 38% an ungenutzten Einnahmen im letzten Jahr an. Molecular Devices, eine US Geräte
Firma mit Schwerpunkt auf der Detektionstechnologie, meldet Einkünfte von 96 M€ für 2000, wobei es
1996 lediglich 40 M€ waren. Es ist anzunehmen, dass Produkte, die aus diesem Projekt hervorgehen
eine noch größere Wachstumsrate verzeichnen werden, falls es das erste Gerät sein wird, das eine lang
erwartete Lösung für eine Reihe von Anforderungen in der Hochdurchsatz Biologie bietet. Somit sollten
Systeme, die in der Systembiologie Anwendung finden, oder allgemeiner in der Hochdurchsatz-Biologie,
komplexe und leistungsstarke Lösungen bieten. Ohne eine starke Verbindung zwischen Zellbiologie und
Software, gibt selbst die raffinierteste Software keinen nützlichen Einblick in das zelluläre Netzwerk.
Deshalb ist es wichtig all diese Elemente parallel zu entwickeln und gut koordinierte Schnittstellen
einzubauen. Vom wirtschaftlichen Standpunkt aus betrachtet bedeutet dies einen hohen finanziellen
Schwellenwert für kleine Unternehmen, aber zu gleich eine exzellente Chance dem Kunden eine
hochwertige Lösung anbieten zu können und somit einen neuen, attraktiven Markt zu schaffen.
Bis heute gibt es keine zufrieden stellende Lösung. Obwohl die Hardware auch für dieses System
grundsätzlich schon entwickelt wurde ist die Nachfrage der Kunden nach biologischen Anwendungen
und begeleitender Software sehr hoch.
Von einem anderen Gesichtspunkt aus betrachtet, könnte man sich auch die globalen Ausgaben der
pharmazeutischen
Industrie
für
R&D
ansehen.
Die
Ausgaben
eines
typischen
großen
Pharmaunternehmens für R&D werden von heute einigen 100 M€ auf mehr als 1 B€ im Jahre 2010
anwachsen. Außerdem wird erwartet, dass die Ausgaben für Hochdurchsatzverfahren einen ähnlichen
Verlauf nehmen werden, allerdings mit einer Verzögerung von einigen Jahren berücksichtigt man die
Genomic-Welle. Der Hauptanteil dieser Ausgaben wird dem internen R&D oder Kooperationen mit der
biotechnologischen Industrie zu gute kommen, eingeschlossen ungefähr 10% Geräteausstattung, sprich
biologische Geräte und IT Geräte, wie sie in diesem Projekt entwickelt werden sollen.
Berücksichtigt man all diese Argumente, scheint ein Verkauf von hunderten von Geräten innerhalb der
nächsten Jahr angemessen, mit einem aggressiven Wachstumsrate. Zusätzlich zum Geräteverkauf
kommt der Verkauf von Softwarekomponenten, Reagenzien und Einwegartikel.
Ein erfolgreiches Ergebnis diese Projekts voraussetzend, könnte das Marketing Scenario wie folgt
aussehen:
Jahr
Verkaufte Systeme
Ertrag in k€ (inklusive Software, Datenbanklösungen,
Reagenzien etc.)
2005
10
2500
2006
20
4000
2007
40
7000
Der indirekte Marktwert bei frühem Zugriff auf diese Technologie ist für die nationale und europäische
Pharma- und Biotechnologieindustrie schwer zu quantifizieren, besonders da die Industrie sich in den
letzten Jahren globalisiert hat. Trotzdem ist es anzunehmen, dass das Netzwerk, das durch dieses
Projekt aufgebaut wird eine wichtige lokale Festung in diesem Gebiet darstellt. Dies beinhaltet nicht nur
Chancen für die großen Pharmaunternehmen, sondern auch für Biotechnologieunternehmen, auch die
die preklinische und klinische Dienste anbieten sowie IT Unternehmen. Die größten Auswirkungen
42
Projekt 3P3137 Systemology
werden bei der Erforschung des Metabolismus und der Ablagerung und Toxikologie von
pharmazeutischen Komponente.
V. Arbeitsteilung/Zusammenarbeit mit Dritten
Die Bearbeitung des Projektes erfolgt in enger Kooperation zwischen der Partner . Alle teilaufgaben sind
so aufeinander abgestimmt, dass die einzelnen Partner gemäß deren Expertise eine effiziente und
schnelle Bearbeitung des Projektes gewährleisten könnon. Zudem verfügen alle Partner über die
notwendige Infrastruktur (Geräte etc.) zur Durchführung des grplantedn vorhabens.
VI. Notwendigkeit der Zuwendung
Unser Vorhaben ist wissenschaftlich, technisch und wirtschaftlich risikoreich. Staatliche Förderung ist für
unser Vorhaben daher unabdingbar notwendig.
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Projekt 3P3137 Systemology
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during
in
vitro
progression
to
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Projekt 3P3137 Systemology
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Projekt 3P3137 Systemology
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46
Projekt 3P3137 Systemology
Anlage
Infrastructure relevant for the project
The IMB: The Institute for Molecular Biotechnology at the RWTH and the Fraunhofer Institute for
Molecular Biology (FhG-IME)
The IMB unites the expertise of the RWTH Institute for Molecular Biotechnology with the Fraunhofer
Institute for Molecular Biology (FhG-IME). The IMB has comprehensive infrastructure and equipment for
life science research ensuring that that all major life science research techniques are available on the
IME campus. Facilities relevant to this project include:

High throughput imaging:
Opera ultra-High throughput Confocal imaging reader from Evotec Technologies. Cytocon 300 cell
handling system from Evotec Technologies on an Olympus IX71 inverted fluorescence microscope.

DNA sequencing:
Perkin Elmer ABI 3700 96 canal capillary sequencer, two ABI310 sequence analyzers and two LiCOR
sequencers.

Biorobotics:
One Beckman BiomekFX 96 channel pipetting system and 2 Beckman Biomek 2000 8 canal pipetting
systems. Genetix QPix 96 needle colony picker and microarray production platform.
GSI Luminomics ScanArray5000 4-laser confocal microarray reader.

Cell Sorting and cell culture:
Becton Dickinson FACS Vantage SE and Becton Dickinson FACS Calibur cell sorting systems, Casy I
cell counter, 7 Heraeus Cell culture incubators, 20 m2 sterile tissue culture lab and 2 sterile tissue culture
hoods.

Imaging systems:
All imaging systems are housed in custom built darkrooms and include:
TCS SP LEICA Spectral Confocal Microscope
One fully quantitative Imaging suite - Princeton Instruments MicroMax-512EBFT frame transfer CCD
camera mounted on a LEICA DM-RB research microscope equipped with excitation and emission filter
wheels.
Two qualitative Imaging suites – 2 Photometrics Sensys CCD cameras mounted on LEICA DM-RB
research microscopes.Two Newport optical tables. Universal Imaging’s complete image analysis and
image capture software suite comprising the Metamorph, Metafluor and Metaview packages.
The consortium and its core competences
The consortium comprises Evotec Technologies, 2 university institutes, a Max Planck Institute and 2
Fraunhofer partners. The consortium is interdisciplinary, bringing together expertise in molecular biology,
optical imaging, image acquisition, liver cell biology, cell based assays, systems informatics and cell
biology.
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Projekt 3P3137 Systemology
Evotec Technologies
Evotec technologies is an industry leader in miniaturized and automated solutions for the life sciences.
Their parent company, Evotec OAI, have become one of the leading providers of drug discovery services
in the world, offering combinatorial libraries and lead optimization, biological assay development and
data generation in high throughput screening.
On the basis of the technology platform developed at Evotec OAI during the past Jahrs, Evotec
Technologies provide systems for miniaturized biochemical and cellular assays, as well as single cell
handling platforms. The company has a strong customer base in the pharmaceutical industry, including
companies like Pfizer, GSK and Novartis.
The IMB: The Institute for Molecular Biotechnology at the RWTH
The IMB has successfully designed and implemented cell based imaging assays and automated
microscopy systems, specifically for imaging endosome fusion, endosome pH and vesicle transport in
living cells. this assay was the first ratio imaging based measurement approach for an intracellular
vesicle fusion in living cells, to our knowledge. It is of particular interest for systems biology because in
the initial paper, we performed at Monte Carlo simulation and modeling of endosome fusion in living cells
based upon the actual data that we obtained from living cell imaging. (Emans et al., 1995) This assay
was further applied to discover that the pathophysiology of the most common genetic disorder in
Caucasians - cystic fibrosis - may be related to defects in vesicle transport and protein transport and
endosome fusion in living cells (Biwersi et al., 1996). furthermore, the principal investigator of the IMB
has an established history in assay development and application to both living cells and in-vitro systems.
(Biwersi et al., 1996; Emans et al., 1995; Emans et al., 1996; Emans and Verkman, 1996; Emans et al.,
2002) The IMB
imaging lab is fully equipped with the imaging
infrastructure required for the
development and application of assays to hepatocytes (see Appendix). This is supported by the
infrastructure provided by the Fraunhofer Society Institute for molecular biology.
The ICCP: Institute of Clinical Chemistry and Pathobiochemistry at the RWTH University Hospital
Research activities of the ICCP focus on the molecular mechanisms that underlie inflammatory and
fibrotic diseases of the liver. Five research groups deal with the investigation of growth-factor mediated
pathogenesis, focussing especially on expression, regulation and signal transduction of Transforming
Growth Factor-beta (TGF-b), as well as PDGF and Glucocorticoids. A wide array of techniques is
routinely in use, among them the isolation and culture of different cell types from rat liver, adenoviral
gene transfer and immuno-histochemical analyses.
The Fraunhofer Institute for Molecular Biology (FhG-IME)
The FhG-IME is focussed on the research and development of recombinant antibodies, pharmaceutical
proteins and applied biotechnological research. The particular strength is the instrument infrastructure
that will be available for the project located on the RWTH Aachen campus.
Fraunhofer Society –Biomolecular Information Processing (BioMIP)
The Fraunhofer BioMIP is a multi-disciplinary research unit concerned with novel information processing
capabilities of biomolecular systems. The BioMIP research unit links five research groups dealing with 1)
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spatially resolved and evolutionary kinetic modeling 2) reconfigurable electronics 3) reconfigurable
microfluidics 4) adaptive biophotonics and 5) molecular selection systems. The unifying focus of
BioMIP’s research is its focus on information processing in complex adaptive and self-organizing
molecular systems: both basic research and applications. In particular BioMIP researchers can point to
twenty years of relevant research in stochastic and spatially resolved biochemical kinetics and complex
system modeling, including hardware encoded massively parallel Monte Carlo modeling, interfaced with
biophysical experiments. BioMIP also has extensive experience in high throughput fluorescence image
analysis and has developed a novel molecule tracker suitable for monitoring sub-cellular events down to
the sub-millisecond timescale.
The Max Planck Society Institute for Cell Biology and Genetics (MPI-CBG)
The Max-Planck-Institute of Molecular Cell Biology and Genetics in Dresden is a recently established (2001)
research institute devoted to the general scientific research theme of how cells form tissues. Beside the
research groups of the five founding directors the institute hosts 17 independent research groups and about
15 scientific services or facilities. The directors, group leaders and service leaders together make up the
faculty of the MPI-CBG. The groups are leaded by molecular cell biologists and developmental biologists
who have been brought together with biochemists, biophysicists and geneticists having expertise in the full
cross section of modern molecular cell biology techniques. Research conducted in the institute is supported
by excellent central facilities. Facilities include protein expression, mass spectrometry, bioinformatics,
antibodies, and DNA sequencing, and all of these technologies are provided as central facilities to support
the research of the group leaders. The institute is particularly strong in imaging techniques as this is
perhaps the principal tool for cell biology. Therefore MPI-CBG has an advanced confocal and light
microscopy imaging facility with an optics technology development unit as well as an electron microscopy
facility. Imaging technology is part of a facility that offers capability to conduct high-throughput genomic
screening on various organisms. The institute also has a transgenic mouse facility and biomedical services
to house and support mouse research. With access to this range of technologies, the researchers within the
MPI-CBG are well supported to be able to concentrate on their chosen research topic.
The institute fosters also the creation of biotech companies and technology transfer. For example, a spin-off
of the institute is Cenix Bioscience, a biotech company dedicated to RNAi-based genomic screening. The
institute currently hosts 4 biotech companies, Cenix Biosciences, Scionics, GeneBridges and Jadolabs.
Marino Zerial is one of the directors of the MPI-CBG. Zerial’s group has pioneered the study of small
GTPases of the Rab family in mammalian cells and, in particular, the role of Rab5 in endocytosis. The group
has considerable experience in molecular and cell biology and has established a number of in vivo and in
vitro assays suitable for studying various aspects of endocytic trafficking. These assays have been
instrumental in the functional analysis of the GTPase Rab5 and its downstream effectors. Zerial’s group has
succeeded in identifying a large number of Rab5 regulatory proteins and effectors making use of the yeast
two-hybrid system, gel overlay and, recently, affinity chromatography. The latter approach has resulted in a
spectacular collection of Rab5 effectors, whose functional characterization is in progress. The combination
of unique background and the large repertoire of techniques available at MPI-CBG will therefore create
excellent opportunities for the scientists working on this project to be competitive in the job market
worldwide. In this respect it is important to consider the success of the host in the training function of young
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Projekt 3P3137 Systemology
scientists. Zerial has trained numerous PhD students (5) and post-docs (more than 20) who are now
independent investigators in various countries in Europe, in Canada, the US and Japan.
Andreas DEUTSCH Zentrum fuer HochleistungsrechnenTechnische Universitaet Dresden
Andreas Deutsch obtained a diploma in mathematics (University of Mainz) and a PhD (University of
Bremen). He had research positions at the University of Bonn (Department of Theoretical Biology) and the
Max Planck Institute for Physics of Complex Systems (Dresden). Since October 2001, he is the leader of the
newly founded department of “Methods of innovative Computing” at the Center of High Performance
Computing (Technical University of Dresden). His research interests include principles of biological pattern
formation, the dynamics of the immune system and mathematical modeling of cancer growth. Andreas
Deutsch is active in the EU-RTN Network “Modeling and Simulation to Improve Cancer Therapy” and has
initiated the interdisciplinary, international competence network MTBio (Modeling and Theory in the
Biosciences, http://www.mtbio.de).
Bianca HABERMANN The Max Planck Society Institute for Cell Biology and Genetics (MPI-CBG)
During her studies at the University of Vienna, Bianca Habermann gained substantial knowledge in
structural and sequence analysis (Diploma studies) of proteins, as well as on molecular biology techniques
during my PhD. During her diploma thesis, she analyzed the physical properties of protein structures and
became an expert user of threading and modeling software packages like the NCBI threader or commercial
modeling software tools, such as InsightII and Sybyl. In the course of her facility leader position at the MPICBG in Dresden, she further improved her expertise in phylogenetic analysis of protein families (Severin, et
al. 2001, Kinoshita, et al., 2002), which will be an essential part for this project on the side of bioinformatics
analysis of Rab5 effectors.
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