ZIP - FreiDok - Albert-Ludwigs

Aus dem Anatomischen Institut I
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Direktor: Prof. Dr. med. M. Frotscher
Die Körnerzellposition beeinflusst die
Faserschichtung der Fascia dentata der Maus:
Eine Studie an Reeler, Apolipoprotein E
Receptor 2 defizienten und Very Low Density
Lipoprotein Receptor defizienten Mäusen
Inauguraldissertation
zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs Universität
Freiburg im Breisgau
vorgelegt 2003
von Carl Alexej Werner Gebhardt
geboren in Ulm/Donau
2
Dekan: Prof. Dr. med. Josef Zentner
1.Gutachter: Prof. Dr. med. Thomas Deller
2.Gutachter: Prof. Dr. med. Stefan Pollak
Jahr der Promotion: 2003
3
Für meine Eltern
4
I Einleitung .................................................................................................................6
I-1 Einführung ..........................................................................................................6
I-2 Die Fascia dentata ..............................................................................................9
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Hippokampus............................11
Abbildung 2: Die Schichten der Fascia dentata ..............................................11
I-3 Reelin und die reeler Maus ...............................................................................13
Abbildung 3: Schematisierte Darstellung der Reelin-Signaltransduktion über
Lipoproteinrezeptoren .....................................................................................15
I-4 Einführung in die verwendeten Techniken ........................................................16
I-4-1 Anterograde Markierung von Nervenfasern mit Hilfe der
Markierungssubstanz Phaseolus vulgaris-Leukoagglutinin ................................16
I-4-2 Immunhistochemie .....................................................................................17
Abbildung 4: Schematische Darstellung der Immunhistochemie mittels der
Avidin-Biotin-Peroxidase Methode ..................................................................18
I-5 Mausmutanten ..................................................................................................18
II Material und Methoden.........................................................................................20
II-1 Verwendete Tiere ............................................................................................20
Abbildung 5: Genotypisierung von vldlr -/-, apoER2 -/- und rl -/- Mäusen
mittels Polymerasekettenreaktion (PCR). .......................................................21
II-2 Tracer Injektionen ............................................................................................21
II-3 Gewebegewinnung und Gewebefixierung .......................................................22
II-4 Immunhistochemie...........................................................................................22
II-4-1 Neuronal Nuclei Immunfärbung ................................................................22
II-4-2 Calbindin Immunfärbung ...........................................................................23
II-4-3 Calretinin Immunfärbung...........................................................................23
II-4-4 Phaseolus vulgaris-Leukoagglutinin Immunfärbung..................................24
II-4-5 Entwicklung ...............................................................................................24
II-4-6 Immunfluoreszenzdoppelfärbung ..............................................................24
II-5 Polymerasekettenreaktion ...............................................................................25
II-6 Digitale Bildverarbeitung ..................................................................................25
III Ergebnisse ...........................................................................................................26
III-1 Verteilung von Nervenzellen in der Fascia dentata.........................................26
III-1-1 NeuN Immunhistochemie.........................................................................26
Abbildung 6: Verteilung von Neuronen in der Fascia dentata von vldlr -/-,
apoER2 -/- und rl -/- Mäusen (NeuN Immunhistochemie). ..............................27
III-1-2 Calbindin Immunhistochemie ...................................................................27
Abbildung 7: Calbindin-positive Körnerzellen in der Fascia dentata von
vldlr -/-, apoER2 -/- und rl -/- Mäusen..............................................................29
III-2 Die Termination entorhinaler Fasern erfolgt schichtenspezifisch....................30
Abbildung 8: Afferenzen aus der entorhinalen Rinde terminieren
schichtenspezifisch in der Fascia dentata von vldlr -/-, apoER2 -/- und rl -/Mäusen ...........................................................................................................31
III-3 Die kommissurale Projektion ..........................................................................32
Abbildung 9: Die geschichtete Termination kommissuraler Fasern ist in
vldlr -/, apoER2 -/- und rl -/- Mäusen gestört...................................................34
III-4 Calretinin-Immunhistochemie zeigt eine veränderte Termination
kommissural/assoziativer Mooszellaxone in vldlr -/-, apoER2 -/- und rl -/Mäusen ..................................................................................................................35
Abbildung 10: Calretinin-Immunhistochemie zeigt Mooszellen und CajalRetzius Zellen in vldlr -/-, apoER2 -/- und rl -/- Mäusen ..................................36
5
III-5 Calretinin- / Calbindin-Doppelimmunfluoreszenzfärbungen bestätigen die
räumliche Assoziation Calbindin-positiver Körnerzellen und Calretinin-positiver
kommissural/assoziativer Fasern...........................................................................38
Abbildung 11: Immunfluoreszenzdoppelfärbung für Calretinin
(kommisural/assoziative Fasern) und Calbindin (Körnerzellen) ......................39
III-6 Calretinin-positive Cajal-Retzius Zellen in vldlr -/-, apoER2 -/- und rl -/Mäusen ..................................................................................................................40
IV Diskussion ...........................................................................................................42
IV-1 Kritische Betrachtung der verwendeten Methoden .........................................42
IV-2 Die Termination entorhinaler Fasern ist unabhängig von Reelin und dem
Reelin-Rezeptor Komplex ......................................................................................44
IV-3 Die geschichtete Termination kommissuraler Fasern hängt von der
Anordnung der Körnerzellen ab .............................................................................46
Abbildung 12: Die Zyto- und Faserarchitektur der Fascia dentata von
Kontrolltieren (+/+), VLDLR- (vldlr -/-), ApoER2 defizienten Mäusen
(apoER2 -/-) und reeler Mäusen (rl -/-)............................................................48
IV-4 Die Reelin-Signaltransduktion und die Entwicklung des Hippokampus ..........49
V Zusammenfassung ..............................................................................................51
VI Zitierte Literatur...................................................................................................52
Danksagung .............................................................................................................62
Lebenslauf................................................................................................................63
Schriftenverzeichnis ...............................................................................................64
Im Rahmen dieser Arbeit ist folgende Publikation entstanden:
Gebhardt C, Del Turco D, Drakew A, Tielsch A, Herz J, Frotscher M, and Deller T
(2002) Abnormal positioning of granule cells alters afferent fiber distribution in the
mouse fascia dentata: morphologic evidence from reeler, apolipoprotein E receptor
2-, and very low density lipoprotein receptor knockout mice. J Comp Neurol, 445:
278-292.
6
I Einleitung
I-1 Einführung
Das zentrale Nervensystem (ZNS) eines gesunden erwachsenen Organismus
zeichnet sich durch eine große Zahl von Nervenzellen aus, die über Nervenfasern
miteinander in geordneter Verbindung stehen. Diese Faserverbindungen entstehen
während der Entwicklungsperiode und bilden die Grundlage für den sinnvollen Ablauf
funktioneller Prozesse im ZNS. Es ist bis heute allerdings unklar, wie spezifische
Verbindungen
zwischen
Nervenzellen
entstehen
können
und
wie
solche
Verbindungen über Jahre hinweg im erwachsenen Organismus aufrecht erhalten und
bei Bedarf modifiziert werden können (Frotscher, 1992; Frotscher, 1991). Die
Aufklärung der molekularen und zellulären Grundlagen dieser Entwicklungsprozesse
ist ein fundamentales Ziel der Entwicklungsneurobiologie.
Ein erfolgreicher experimenteller Ansatz, um zu einem besseren Verständnis
entwicklungsneurobiologischer Prozesse im Gehirn zu kommen, ist die genetische
und
morphologische
Untersuchung
von
Mausmutanten.
Insbesondere
die
Erforschung von solchen Mutanten, bei denen eine abnormale Zytoarchitektur des
Gehirns zu beobachten ist, hat dazu geführt, dass wir in den vergangenen Jahren
viel über diejenigen Gene und Moleküle gelernt haben, die eine geordnete
Zellmigration und Schichtung der kortikalen Neurone während der Gehirnentwicklung
steuern (Rice and Curran, 1999). Beispielhaft hierfür ist die neurobiologische
Untersuchung der ataktischen Mausmutante reeler, bei der ausgeprägte Störungen
der Zytoarchitektur des ZNS zu bobachten sind (Caviness and Rakic, 1978; zur
Übersicht: Lambert and Goffinet, 1998). Bei diesen Mäusen kommt es zu Störungen
der Nervenzellmigration während der Entwicklung: Die Nervenzellen werden
zunächst im Bereich der Ventrikulärzone gebildet und wandern daraufhin radiär
entlang von Gliazellfortsätzen nach außen. Später gebildete Neurone passieren
dabei die früher gebildeten, so dass die oberflächlichen Schichten des Kortex jünger
sind als die tiefen. Die Schichten entwickeln sich also, wenn man die zeitliche
Abfolge betrachtet, von innen nach außen. Im Gegensatz hierzu gelingt es den
später gebildeten Neuronen in reeler Mutanten jedoch nicht, an den früher gebildeten
vorbeizuwandern, so dass der Kortex der reeler Maus invers aufgebaut ist (Bar et al.,
7
2000b; Rice and Curran, 1999; Ogawa et al., 1995; Caviness, Jr., 1982). Mit Hilfe
molekulargenetischer Techniken konnte vor wenigen Jahren das mutierte Gen der
reeler Mäuse identifiziert werden (D'Arcangelo et al., 1996; D'Arcangelo et al., 1995;
Ogawa et al., 1995). Es konnte gezeigt werden, dass den reeler Mutanten das
Extrazellulärmatrixprotein Reelin fehlt, das für eine geordnete Migration von
Neuronen entlang der radialen Gliazellen während der Entwicklung verantwortlich ist
(Caviness, Jr., 1982).
Es stellte sich jetzt die Frage, wie Reelin die Migration von Nervenzellen im
sich entwickelnden ZNS reguliert. Es gelang die Rezeptoren von Reelin zu
identifizieren
und
den
Signaltransduktionsweg
von
Reelin
in
Nervenzellen
aufzuklären. Es zeigte sich, dass ein Rezeptorkomplex aus Lipoproteinrezeptoren mit
Reelin interagiert und über eine intrazelluläre Signalkaskade die Adhäsion
migrierender Nervenzellen reguliert. Von entscheidender Bedeutung waren in diesem
Zusammenhang Untersuchungen weiterer Mausmutanten, die den reeler Mäusen
ähnliche Phänotypen zeigen. So kommt es bei Mäusen mit Mutationen im disabled-1
(Dab-1) Gen (Sheldon et al., 1997; Howell et al., 1997; Ware et al., 1997) ebenso wie
bei Mäusen mit Mutationen in den Genen der Lipoproteinrezeptoren ApoER2
(Apolipoprotein E Rezeptor 2) und VLDLR (very-low-density Lipoproteinrezeptor)
(Trommsdorff et al., 1999) zu reeler ähnlichen Veränderungen. Es konnte gezeigt
werden, dass ApoER2 und VLDLR als Rezeptorkomplex für das Protein Reelin
fungieren (Hiesberger et al., 1999; D'Arcangelo et al., 1999). Die Bindung von Reelin
an diese Rezeptoren führt zur Phosphorylierung des intrazellulären Proteins Dab-1
(Keshvara et al., 2001; Howell et al., 1999; Hiesberger et al., 1999).
Somit kann man die Ähnlichkeit der neuropathologischen Veränderungen
dieser Mausmutanten gut erklären. Da diese Veränderungen allerdings auf
unterschiedlichen Störungen im Reelin-Signaltransduktionsweg beruhen, kann man
durch die genaue Analyse der Morphologie dieser Mausmutanten zum einen
Hypothesen überprüfen, die aufgrund von Untersuchungen an reeler Mäusen
aufgestellt wurden. Zum anderen kann man möglicherweise Rückschlüsse auf die
Funktion
der
einzelnen
Entwicklungsprozess ziehen.
Elemente
des
Signaltransduktionsweges
im
8
In den letzten Jahren wurde die Fascia dentata der reeler Maus intensiv
untersucht, da sie im Vergleich mit dem Neokortex eine einfache Zell- und
Faserschichtung besitzt. So findet sich in der normalen Fascia dentata eine einzige
Zellschicht, die Körnerzellschicht. An den Dendriten der dicht gepackten Körnerzellen
enden zwei mächtige Faserschichten: Fasern aus dem entorhinalen Kortex (EC)
enden an distalen Teilen des Dendritenbaumes in der äußeren Molekularschicht
(OML), während kommissurale Afferenzen (COM) aus dem kontralateralen
Hippokampus an proximalen Teilen der Körnerzelldendriten in der inneren
Molekularschicht (IML) enden (Frotscher et al., 1991; Blackstad, 1958; Blackstad,
1956;). Aufgrund dieser Zell- und Faserarchitektur wurde vorgeschlagen, dass
Signale auf definierten Abschnitten der Körnerzelldendriten die Terminationszone der
Afferenzen bestimmen. Somit würden Signale auf den distalen Körnerzelldendriten
entorhinale Fasern in ihre Zielschicht lenken, während Signale auf den proximalen
Körnerzelldendriten kommissurale Fasern in ihre Zielschicht führen würden. Eine
Trennung der entorhinalen und kommissuralen Faserschichten ließe sich mit der
kompakten Anordnung der Körnerzellen, spezifischen molekularen Signalen auf
distalen bzw. proximalen Abschnitten der Körnerzelldendriten und der parallelen
Anordnung der Körnerzelldendriten, erklären.
Mit der reeler Maus, in der die Körnerzellen abnormal verteilt sind (Stanfield
and Cowan, 1979b; Stirling and Bliss, 1978; Caviness and Rakic, 1978; Caviness
and Sidman, 1973; Falconer, 1951), bot sich erstmals die Gelegenheit zur
Überprüfung dieser klassischen Hypothese. Falls die Hypothese richtig wäre, dürfte
sich in der Fascia dentata der reeler Maus keine normale Faserschichtung mehr
entwickeln. Überraschenderweise zeigten Untersuchungen zur Faserschichtung der
reeler
Maus
jedoch,
schichtenspezifische
dass
eine
Termination
gestörte
kommissuraler
Körnerzellverteilung
Afferenzen
nur
die
beeinflusst,
die
schichtenspezifische Termination entorhinaler Afferenzen hingegen erhalten bleibt
(Deller et al., 1999a; Stanfield et al., 1979). Für die Wegfindung der entorhinalen
Fasern scheinen demnach andere Mechanismen entscheidend zu sein. CajalRetzius Zellen, die vorübergehend während der Hirnentwicklung vorhanden sind,
bilden transiente Synapsen mit den einwachsenden entorhinalen Fasern aus und
dienen ihnen vermutlich als Leitschiene in die äußere Molekularschicht der Fascia
dentata (Ceranik et al., 2000; Ceranik et al., 1999; Del Rio et al., 1997). Dieses
9
Führungssystem ist auch in reeler Mäusen vorhanden (Deller et al., 1999a). Für die
kommissuralen Afferenzen scheint allerdings in der Tat die Position ihrer
postsynaptischen
Zielzellen
und
damit
auch
die
Position
der
vermuteten
Führungssignale entscheidend zu sein, da wie oben bereits erwähnt, in reeler
Mäusen das Terminationsmuster der kommissuralen Afferenzen mit der Verteilung
der Körnerzellen korreliert (Deller et al., 1999a).
In den vergangenen Jahren wurde jedoch vorgeschlagen, dass auch im Fall
der kommissuralen Faserprojektion GABAerge Pionierneurone und nicht die
Körnerzellen für das Einwachsen kommissuraler Fasern entscheidend sind (Borrell et
al., 1999). Es wurde vermutet, dass diese Pionierneurone eine ähnliche Funktion wie
Cajal-Retzius Zellen haben und einwachsenden kommissuralen Fasern als
Leitschiene dienen könnten. Die Verfügbarkeit von vldlr -/- und apoER2 -/- Mäusen
ermöglichte es uns jetzt, die umstrittene Rolle der Körnerzellen für die kommissurale
Schichtung genauer zu untersuchen. Da die Störung der Körnerzellverteilung in
diesen Mutanten weniger stark ausgeprägt ist, als in den reeler Mäusen, sollte es in
diesen Mausmutanten zu einer weniger ausgeprägten Störung der kommissuralen
Fasertermination kommen. Wir untersuchten daher die Zyto- und Faserarchitektur
dieser Mausmutanten und korrelierten den Grad der Störung der Körnerzellverteilung
mit dem Grad der Störung der Faserschichtung entorhinaler und kommissuraler
Afferenzen.
I-2 Die Fascia dentata
Der
Hippokampus
entwicklungsneurobiologischen
ist
zur
experimentellen
Fragestellungen
Untersuchung
ein
häufig
von
verwendetes
Modellsystem. Aufgrund seiner geordneten Zyto- und Faserarchitektur gilt er als ein
vergleichsweise einfach gebauter Teil des Kortex. Seine Entwicklung (Bayer and
Altman, 1987; Stanfield and Cowan, 1979a), sein zellulärer Aufbau (Amaral and
Witter, 1995; Frotscher et al., 1988), sowie seine intrinsischen und extrinsischen
Verschaltungen sind in der Vergangenheit intensiv untersucht und zum Teil
aufgeklärt
worden
Experimentator,
die
(Amaral
and
molekularen
Witter,
und
1995).
Dies
zellulären
erleichtert
es
dem
Zusammenhänge
von
10
Entwicklungsprozessen zu untersuchen und aufzuklären (Frotscher et al., 1995;
Frotscher et al., 1988). Darüber hinaus lässt sich der junge Hippokampus
explantieren und über Wochen in vitro kultivieren. Mit Hilfe dieser organotypischen
Schnittkulturen
des
Hippokampus
lassen
sich
entwicklungsbiologische
Fragestellungen elegant untersuchen und experimentell beeinflussen (Gähwiler et
al., 1997; Heimrich and Frotscher, 1993). Auf diese Weise konnten einige der Zellen
und Moleküle identifiziert werden, die an der Entwicklung spezifischer Verbindungen
im Hippokampus beteiligt sind (Skutella and Nitsch, 2001; Del Rio et al., 1997).
Die Fascia dentata ist Teil der Hippokampusformation, die sich aus Fascia
dentata, Hippokampus (auch Ammonshorn genannt, welches nochmals in CA1, CA2
und CA3 unterteilt wird), Subiculum, Präsubiculum, Parasubiculum und entorhinalem
Kortex zusammensetzt. Während frühere Untersucher den Hilus noch als Teil des
Ammonshorn ansahen und ihn als CA4 bezeichneten (de No, 1934), so wird er heute
als Teil der Fascia dentata gesehen und synonym als polymorphe Schicht der Fascia
dentata bezeichnet (Amaral and Witter, 1995). Die dreidimensionale Ausdehnung
macht es nötig, bestimmte Teile näher zu bezeichnen: so spricht man von einem
suprapyramidalen und einem infrapyramidalen Blatt der Fascia dentata, wobei das
suprapyramidale Blatt benachbart zu CA1 liegt und an der Spitze des Gyrus dentatus
in das infrapyramidale Blatt übergeht (Abbildung 1). Außerdem spricht man von
einem septalen, eher rostral gelegen Teil und einem temporalen, eher dorsolateral
gelegenen Teil.
Die Fascia dentata wird aufgrund ihres relativ einfachen Aufbaus häufig als
Modellsystem zur Untersuchung von neurobiologischen Fragestellungen verwendet.
Sie besteht aus einer einzigen Zellschicht, der Körnerzellschicht. Oberhalb der
Körnerzellschicht findet sich eine Faserschicht, die Molekularschicht, die ihrerseits in
zwei Bereiche unterteilt wird, in die innere und die äußere Molekularschicht
(Abbildung 1 und 2). Diese Unterteilung der Molekularschicht erfolgt aufgrund der
Schichtung zweier mächtiger afferenter Fasersysteme, die in diesen Bereichen der
Molekularschicht
enden.
Im
Bereich
der
inneren
Molekularschicht
enden
hippokampale Assoziationsfasern und Kommissurenfasern, während im Bereich der
äußeren Molekularschicht Fasern aus dem ipsilateralen entorhinalen Kortex enden.
11
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Hippokampus
Zu sehen ist die Pyramidenzellschicht (schwarz), mit den Regionen CA1 und CA3. Die Fascia
dentata ist ebenfalls zu sehen mit Ihrer Körnerzellschicht (KZS blau), der inneren
Molekularschicht (IMS, grün), der äußeren Molekularschicht (ÄMS, rot) und dem Hilus (H).
Innere und äußere Molekularschicht lassen sich nur aufgrund der Termination der
verschiedenen Afferenzen unterscheiden. In der Inneren Molekularschicht enden die
kommissural/assoziativen Fasern, in der äußeren Molekularschicht die Fasern aus dem
entorhinalen Kortex. Die Körnerzellschicht wird zudem noch in ein suprapyramidales Blatt
(SPB) unterteilt, dass an der Spitze der Fascia dentata in das infrapyramidale Blatt (IPB)
übergeht.
Abbildung 2: Die Schichten der Fascia
dentata
Schematisierte
Darstellung
der
Schichten der Fascia dentata. Zu sehen
sind der Hilus (H), die Körnerzellschicht
(KZS), die innere Molekularschicht (IMS)
und die äußere Molekularschicht (ÄMS).
Exemplarisch ist eine Körnerzelle in der
Körnerzellschicht abgebildet, deren
apikaler
Dendritenbaum
in
die
Molekularschicht
ragt.
Die
Molekularschicht
wird
in
zwei
Faserschichten unterteilt. In der inneren
Molekularschicht
enden
die
kommissural/assoziativen (C/A) Fasern,
in der äußeren Molekularschicht die
Fasern aus der entorhinalen Rinde (EC).
12
Die entorhinalen Afferenzen ziehen als Fasertrakt gebündelt (Tractus
perforans)
zum
ipsilateralen
Hippokampus.
Sie
entstammen
überwiegend
sternförmigen Neuronen der Schicht II (Steward and Scoville, 1976) und sind
glutamaterg. Des weiteren kommen Fasern GABAerger Neurone aus Schicht I und III
hinzu (Germroth et al., 1991; Germroth et al., 1989), sowie eine kleine Population
von Fasern deren Ursprungszellen in Schicht IV-VI liegen (Deller et al., 1997;
VonHaebler et al., 1993; Köhler, 1985). Mit retrograden Tracingmethoden wurde die
Topographie der Projektion entorhinaler Zellen zur Fascia dentata aufgeklärt (Ruth et
al., 1988; Ruth et al., 1982; Steward and Scoville, 1976). Es konnte gezeigt werden,
dass Zellen aus dem dorsalen Teil des entorhinalen Kortex in septale Regionen der
Fascia dentata projizieren, während weiter ventral liegende Zellen in temporale
Regionen projizieren.
Die Ursprungszellen der kommissuralen Projektion sind ebenfalls heterogen.
Der Großteil der Fasern entstammt glutamatergen, im Hilus gelegenen, Calretininpositiven Mooszellen (Scharfman, 1995; Soriano and Frotscher, 1994; Frotscher et
al., 1991; Amaral, 1978). Ein kleinerer Teil entstammt GABAergen Interneuronen.
Diese sind in sich heterogen. Außerdem noch (1) Somatostatin- (Leranth and
Frotscher, 1987) und Neuropeptid Y- (Deller and Leranth, 1990) haltigen Zellen, die
Subpopulationen GABAerger (Kosaka et al., 1988) Neurone sind (2) GABAerge,
Parvalbuminhaltige (Goodman and Sloviter, 1992) Neurone und (3) verschiedene
GABAerge Neurone, die keinen anderen der obengenannten Marker enthalten
(Leranth and Frotscher, 1987; Sloviter and Nilaver, 1987). Die allermeisten Zellen die
zum kontralateralen Hippokampus projizieren entsenden ebenfalls Fasern zum
ipsilateralen Hippokampus, weshalb man auch von kommissural/assoziativen (C/A)
Fasern spricht (Zappone and Sloviter, 2001).
Die Termination der kommissural/assoziativen (C/A) Fasern und der Axone
aus der entorhinalen Rinde (EC) erfolgt im Wildtyp in einer schichtenspezifischen Art
und Weise. Der Großteil der entorhinalen Fasern terminiert in der äußeren
Molekularschicht an distalen Abschnitten von Körnerzelldendriten. Einige wenige
Fasern enden in der inneren Molekularschicht, der Körnerzellschicht und im Hilus
(Deller et al., 1997). Die kommissuralen Fasern enden an proximalen Abschnitten
der Körnerzelldendriten im Bereich der inneren Molekularschicht (Abbildung 2). Ein
13
kleiner Teil der C/A Fasern endet in der äußeren Molekularschicht und im Hilus
(Deller et al., 1995).
Die wichtigste Efferenz der Fascia dentata sind die Moosfaseraxone der
Körnerzellen.
Bereits
Ramón
y
Cajal
beschrieb
diese
charakteristischen
unmyelinierten Axone und gab Ihnen Ihren Namen (Cajal, 1911). Sie enden an den
Pyramidenzellen in der Region CA3, bilden davor jedoch mehrere Kontakte mit
Mooszellen im Hilus und mit mehreren anderen Interneuronen (Amaral and Witter,
1995). Die Moosfasern sind also intrahippokampale assoziative Fasern, was die
Fascia dentata als Haupteingangstür zum Ammons Horn erscheinen lässt.
I-3 Reelin und die reeler Maus
Die reeler Maus ist eine spontan aufgetretene ataktische Mausmutante, die
erstmals von Falconer Anfang der Fünfziger Jahre beschrieben wurde (Falconer,
1951). Ihren Namen erhielt sie aufgrund ihres auffälligen schwankend-ataktischen
Gangbilds (Engl.: "reeling gait"). Der Gendefekt der reeler Maus blieb für mehr als 40
Jahre unbekannt und Untersuchungen zur reeler Maus konzentrierten sich zunächst
ausschließlich
auf
die detaillierte Beschreibung ihrer pathomorphologischen
Veränderungen (zur Übersicht: Lambert and Goffinet, 1998).
So wurden die Störungen der Zytoarchitektur im Kortex untersucht und es
wurde gezeigt, dass es den Neuronen in der reeler Maus nicht gelingt, sich in
Schichten anzuordnen. Die kortikalen Zellen sind bunt "durchmischt" und eine klare
Ordnung ist nicht mehr erkennbar (Stanfield and Cowan, 1979b; Caviness and
Sidman, 1973). Morphologische Veränderungen sind in reeler Mäusen allerdings
auch in subkortikalen Bereichen des ZNS vorhanden, wie dem Thalamus, dem
Mittelhirn, dem Hirnstamm und dem Rückenmark (Frost et al., 1986; Goffinet et al.,
1984).
Die charakteristische Störung der kortikalen Zytoarchitektur, insbesondere die
umgekehrte Schichtung der Nervenzellen im Kortex, machte die reeler Maus zu
einem
interessanten
Untersuchungsobjekt
für
entwicklungsneurobiologische
Fragestellungen. Insbesondere konnte erstmals der Frage nachgegangen werden,
14
inwiefern die korrekte Positionierung von Neuronen innerhalb des ZNS und ihre
Anordnung in Zellschichten eine Voraussetzung für die Entstehung spezifischer
neuronaler Verbindungen ist. Es zeigte sich, dass Nervenzellen in reeler Mäusen
durchaus dazu in der Lage sind, sinnvolle synaptische Kontakte aufzubauen, obwohl
ihre Zielzellen fehlpositioniert sind. Diese Befunde legten nahe, dass es sich beim
Gendefekt der reeler Maus um ein Gen handelt, das für die Migration von
Nervenzellen während der Entwicklung entscheidend ist, auf die molekularen
Mechanismen, die zur Bildung spezifischer Verbindungen im ZNS führen, aber
keinen entscheidenden Einfluss haben kann (Rakic and Caviness, 1995).
Erst mehr als 40 Jahre nach der Erstbeschreibung der reeler Maus wurde das
zugehörige Gen (D'Arcangelo et al., 1995) und das von ihm kodierte Protein (Ogawa
et al., 1995) entdeckt. Reelin besteht aus 3461 Aminosäuren und hat ein relatives
Molekulargewicht vom 388 kDa (D'Arcangelo et al., 1995). Es ist ein hochgradig
konserviertes Molekül: die Aminosäuresequenzen von humanem Reelin und mäuse
Reelin stimmen zu 94,2% überein, während die Nukleotidsequenzen noch zu 87,2%
Übereinstimmung zeigen (DeSilva et al., 1997). Dies spricht dafür, dass Reelin ein
phylogenetisch altes Protein und dementsprechend wichtig für die kortikale
Entwicklung ist (Bar et al., 2000a).
Die Untersuchung von weiteren Mausmutanten, die einen der reeler Maus
ähnlichen neurologischen und neuropathologischen Phänotyp zeigten, führte zu
weiteren Erkenntnissen. So führten sowohl Mutationen im disabled-1 (Dab-1) Gen
(Sheldon et al., 1997; Howell et al., 1997; Ware et al., 1997) als auch Mutationen in
den Genen der Lipoproteinrezeptoren ApoER2 und VLDLR (Trommsdorff et al.,
1999) zu reeler ähnlichen Veränderungen. Es zeigte sich, dass Dab-1, VLDLR und
ApoER2 Bestandteile der Reelin-Signaltransduktionskaskade sind, deren Grundzüge
heute aufgeklärt sind (Abbildung 3): als Rezeptoren für Reelin fungieren der
Apolipoprotein E Receptor 2 (ApoER2) und der very low density lipoprotein receptor
(VLDLR) (Trommsdorff et al., 1999). An diese bindet Reelin (Hiesberger et al., 1999;
D'Arcangelo et al., 1999), was zur Phosphorylierung des intrazellulären Proteins
Dab-1 führt (Keshvara et al., 2001; Howell et al., 1999; Hiesberger et al., 1999). In
einem alternativen Signalweg bindet Reelin an α3β1 Integrin, wodurch die Ablösung
15
der migrierenden Nervenzellen von den radialen Gliazellen reguliert werden könnte
(Dulabon et al., 2000).
CR-Zelle
reeler
Maus
Reelin
vldlr -/Maus
apoEr2 -/Maus
ApoER2
b1
Da
Src
P
P
Da
D
b1
VLDLR
Cdk5
Abbildung
3:
Schematisierte
Lipoproteinrezeptoren
Darstellung
der
Reelin-Signaltransduktion
über
Das Protein Reelin (lila) wird von Cajal-Retzius Zellen (gelb) sezerniert. Es bindet an den
Reelin-Rezeptor Komplex, bestehend aus ApoER2 und VLDLR, was zur intrazellulären
Phosphorylierung von Dab-1 führt. Dies führt vermutlich zu einer Aktivierung der Cyclin
abhängigen Kinase 5 (Cdk5, hellgrün).
16
I-4 Einführung in die verwendeten Techniken
I-4-1
Anterograde
Markierung
von
Nervenfasern
Markierungssubstanz Phaseolus vulgaris-Leukoagglutinin
mit
Hilfe
der
Schon zur Zeit von Cajal und Golgi war die Markierung neuraler Verbindungen
eine große Herausforderung. Ohne dafür gut geeignete Methoden, ist die
Erforschung neuraler Funktion sowie neuraler Plastizität kaum vorstellbar. Zu Beginn
der Erforschung neuraler Konnektivität standen nur die Methoden der antero- und
retrograden Degeneration zur Verfügung. Der nächste Schritt war die von Golgi
entwickelte Silberimprägnation einzelner Neurone (Golgi, 1879). Erst viel später war
es mittels neuer Degenerationsmethoden möglich, anterograd die Projektion eines
Kerngebietes zu studieren (zum Beispiel: Fink and Heimer, 1967). Diese Techniken
waren insbesondere für lange Verbindungen geeignet, die nicht mittels der
Golgimethode sichtbar gemacht werden konnten. Mit der Entdeckung des anteround retrograden Axontransports wurden neue Methoden entwickelt. Die Nutzung von
Meerrettich-Peroxidase als retrogradem Tracer (Kristensson and Olsson, 1971; zur
Übersicht: Vercelli et al., 2000 und Cowan and Cuénod, 1975) stellte eine deutliche
Verbesserung dar. Diese Technik machte es möglich, axonale Verbindungen in vivo
sowohl retrograd als auch anterograd zu markieren. Etwa zur gleichen Zeit
entwickelten Cowan und Kollegen (Cowan et al., 1972) die Technik der
Autoradiographie,
um
axonale
Verbindungen
mittels
radioaktiv
markierter
Aminosäuren zu untersuchen. Mit der Entdeckung von Phaseolus vulgarisLeukoagglutinin (PHAL) als Tracersubstanz (Gerfen and Sawchenko, 1984) wurde
eine bis dahin nicht mögliche Auflösung erreicht. Einzelne Axone und Axonterminale
konnten
mit
PHAL
sichtbar
gemacht
werden.
Dies
war
davor
nur
mit
immunhistochemischen Methoden für die entsprechenden Subpopulationen von
Neuronen möglich, lässt aber im Gegensatz zum Tracingexperiment keine Aussagen
über ganze Projektionsbahnen zu, die ja häufig biochemisch heterogen aufgebaut
sind (siehe I-2 Die Fascia dentata).
PHAL gehört zu einer biochemisch heterogenen Gruppe pflanzlicher Lektine.
Es wird aus der Bohne (Phaseolus vulgaris) gewonnen. Phaseolus vulgarisAgglutinin (PHA) ist bekannt dafür, das Wachstum und die Teilung von Lymphozyten
zu stimulieren, sowie Blutzellen zu agglutinieren (Weber et al., 1972). Sein
17
Molekulargewicht beträgt 126000, es besteht aus vier Untereinheiten wobei diese
sich in zwei weitere Untereinheiten auftrennen lassen. Diese werden als E und L
Formen bezeichnet, entsprechend Ihrer Fähigkeit hauptsächlich Erythrozyten bzw.
Leukozyten zu agglutinieren (Leavitt et al., 1977), wobei nur PHAL als Tracer in den
Neurowissenschaften von Bedeutung ist. PHAL bindet an N-acetyl-glucosamin, wird
von Nervenzellen schnell aufgenommen und mit dem anterograden axonalen
Transport mit einer Geschwindigkeit von 4-6 mm pro Tag transportiert (Gerfen and
Sawchenko, 1984; zur Übersicht: Vercelli et al., 2000). Die Applikation erfolgt
iontophoretisch mit 5-6 µA Stromstärke. Die Visualisierung erfolgt mittels
Immunhistochemie, wobei die Färbungen in histologischen Präparaten über mehrere
Jahre stabil bleiben (Wouterlood et al., 1990). Die Überlebenszeit nach Injektion
sollte 10-20 Tage betragen, je nach Länge des darzustellenden Fasertrakts. Zu lange
Überlebenszeiten
führen
zu
einer
Verschlechterung
des
Färbeergebnisses
(Wouterlood et al., 1990). Mit PHAL lassen sich auch elektronenmikroskopische
Studien durchführen (Pare et al., 1995) und man kann es in Kombination mit anderen
Tracern und für doppelimmunhistochemische Färbungen verwenden (Deller et al.,
2000; Dolleman-Van der Weel MJ et al., 1994). Alle diese Eigenschaften machen
PHAL zu einem leicht und sicher applizierbaren, zuverlässigen, hochauflösenden
und vielseitigen Tracer im neurowissenschaftlichen Bereich.
I-4-2 Immunhistochemie
Mit Hilfe von Antikörpern, die gegen bestimmte Merkmale von Nervenzellen
oder Gliazellen gerichtet sind, lassen sich selektiv bestimmte Zelltypen oder
Subpopulationen von Nervenzellen (z.B. Mooszellen oder Calbindin-positive Zellen)
markieren. Dadurch ist es möglich, die biochemische Heterogenität morphologisch
ähnlicher Nervenzellen darzustellen. Die Herstellung und Entwicklung immer neuer
Antikörper führte in den Neurowissenschaften zu einem enormen Wissenszuwachs.
Doppelimmunhistochemische Färbungen ermöglichen sogar die Darstellung zweier
verschiedener Antigene.
Die Immunhistochemie beruht auf der spezifischen Bindung von Antikörpern
an das entsprechende Antigen. Zur Darstellung des Antigen-Antikörper Komplexes
18
stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. Zur Vereinfachung wird hier nur das
von uns verwendete beschrieben.
Peroxidase
Abbildung
4:
Schematische
Darstellung der Immunhistochemie
mittels der Avidin-Biotin-Peroxidase
Methode
Avidin
Biotin
Das Fab-Fragment (gelb) des
verwendeten
Antikörpers
(AK)
bindet das entsprechende Antigen
Erstantikörper
(blau). Das Fc-Fragment (rot) des
AK ist biotiniliert. Das Coenzym
Biotin (orange) reagiert mit dem aus
Eiklar gewonnenen Avidin (grün).
Das Avidin ist mit Peroxidase
(hellgrün) gekoppelt, welche nach
Antigen
Zugabe
des
Indikators
die
Farbreaktion katalysiert. Da Avidin vier Bindungsstellen für Biotin hat, kommt es zu einer
Verstärkung der Färbung. Ist der Erstantikörper noch nicht mit Biotin gekoppelt, wird ein
biotinilierter Zweitantikörper verwendet, der gegen das Fc-Fragment des Erstantikörpers
gerichtet ist.
Ist bereits der direkt gegen das nachzuweisende Antigen gerichtete Antikörper
(Erstantikörper) mit einem Biotin Molekül gekoppelt, kann man direkt die AvidinBiotin-Methode (Hsu et al., 1981) anwenden. Das Coenzym Biotin reagiert mit dem
an Peroxidase gekoppelten Avidin und bildet einen stabilen Komplex (siehe
Abbildung 4). Die Peroxidase reduziert nach Zugabe von Wasserstoffperoxid den
Indikator 3,3’-Diaminobenzidin, der in seiner reduzierten Form intensiv braun gefärbt
ist. Zur Verstärkung der Färbung wurde in unserem Fall noch Ammonium-NickelSulfat und Cobalt-Chlorid hinzugegeben, was in einer dunkelblau bis schwarzen
Färbung resultiert.
I-5 Mausmutanten
Die Untersuchung von Mausmutanten mit neurologischen Veränderungen ist
eine sinnvolle Strategie, um die Entwicklung des ZNS besser zu verstehen. In den
vergangenen vier Dekaden wurden große Fortschritte gemacht, die Gene zu
identifizieren, die für die korrekte Zellpositionierung während der Hirnentwicklung von
Mäusen und Menschen nötig sind (Walsh, 1999; D'Arcangelo and Curran, 1998).
Viele Jahre diente die bereits oben erwähnte Mausmutante reeler als Prototyp zur
19
Untersuchung von Mutationen, die die neurale Migration und die Organisation des
ZNS betreffen. Nach der Identifikation des reeler Gens (D'Arcangelo et al., 1995)
wurden in kurzer Zeit weitere Gene entdeckt, die ebenfalls für neuronale Migration
entscheidend sind. Dazu gehören das disabled-1 Gen (Howell et al., 1997; Sheldon
et al., 1997; Ware et al., 1997), das Gen für die Cyclin abhängige Kinase 5 (Cdk5)
oder den spezifischen neuronalen Aktivator für Cdk5, p35 (Chae et al., 1997;
Ohshima et al., 1996). Vor kurzem wurde berichtet, das Mäuse denen entweder
ApoER2 oder VLDLR fehlen einen reeler ähnlichen Phänotyp und ähnliche
neuropathologische Veränderungen zeigen und das die Bindung von Reelin an diese
Rezeptoren zur intrazellulären Phosphorylierung von Dab-1 führt (D'Arcangelo et al.,
1999; Hiesberger et al., 1999; Trommsdorff et al., 1999).
Vom reeler Phänotyp gibt es verschiedene Mutationen. Die heutzutage meist
nur als reeler (rl) bezeichnete Mutation trat erstmals spontan 1948 in Edinburgh,
Schottland auf und wurde 1951 beschrieben (Falconer, 1951). Nach Ihrer Herkunft
wird diese Mutation manchmal noch als rled bezeichnet. Für diese Studie wurden
reeler Mäuse mit diesem Allel verwendet. Ein anderes natürlich vorkommendes Allel
ist rlorl, das 1961 in einem BALB/c Stamm in Orleans, Frankreich auftrat (Guenet,
1961). In den letzen Jahren wurden drei weitere Allele durch Mutagenese erzeugt. rltg
wurde im Roche Institut für Molekularbiologie in Nutley, NJ während der Generierung
eines transgenen Stammes erzeugt (Miao et al., 1994). rlAlb1 und rlAlb2 wurden in
Albany, NY während einer Studie über Chlorambucil induzierte Mutationen erzeugt
(Flaherty et al., 1992). Der Phänotyp aller bekannten reeler Allele ist sehr ähnlich und
die Unterschiede lassen sich auf den unterschiedlichen genetischen Hintergrund
zurückführen (zur Übersicht: D'Arcangelo and Curran, 1998).
Die anderen in dieser Studie verwendeten Mausmutanten, die ApoER2- und
VLDLR-defizienten
Mäuse
sind
mittel
gene
(Trommsdorff et al., 1999; Frykman et al., 1995;).
targeting
hergestellt
worden
20
II Material und Methoden
II-1 Verwendete Tiere
Es wurden insgesamt 68 männliche und weibliche Mäuse verwendet (Alter:
zwischen 2 und 3 Monate). Die Tiere wurden unter Standardbedingungen (12
stündiger Tag und Nacht Zyklus; Mäusefutter und Wasser zur freien Verfügung)
gehalten und in vier experimentelle Gruppen aufgeteilt:
•
Gruppe 1: Kontrolltiere (n=26; C57/BL6 n=14; B6/C3H n=12). Als Kontrollen
wurden Mäuse verwendet, die auf dem gleichen genetischen Hintergrund
gezüchtet wurden, wie die jeweiligen Mutanten. Der genetische Hintergrund
der apoER2 -/- und vldlr -/- Mausmutanten ist C57/BL6, der genetische
Hintergrund der rl -/- Mutanten ist B6/C3H. Jeweils eine Hälfte der Tiere erhielt
PHAL-Injektionen in den EC zur Markierung des Tractus perforans, die zweite
Hälfte der Tiere erhielt PHAL-Injektionen in den Hilus der Fascia dentata zur
Darstellung der kommissuralen Faserprojektion.
•
Gruppe 2: VLDLR-defiziente Mäuse (n=14). Die Hälfte der Tiere erhielt PHALInjektionen in den EC zur Markierung des Tractus perforans, die zweite Hälfte
der Tiere erhielt PHAL-Injektionen in den Hilus der Fascia dentata zur
Darstellung der kommissuralen Faserprojektion.
•
Gruppe 3: ApoER2-defiziente Mäuse (n=14). Die Hälfte der Tiere erhielt
PHAL-Injektionen in den EC zur Markierung des Tractus perforans, die zweite
Hälfte der Tiere erhielt PHAL-Injektionen in den Hilus der Fascia dentata zur
Darstellung der kommissuralen Faserprojektion.
•
Gruppe 4: Reeler Mäuse (n=14). Die Hälfte der Tiere erhielt PHAL-Injektionen
in den EC zur Markierung des Tractus perforans, die zweite Hälfte der Tiere
erhielt PHAL-Injektionen in den Hilus der Fascia dentata zur Darstellung der
kommissuralen Faserprojektion.
21
Der Genotyp sämtlicher Tiere wurde mittels genomischer PCR bestimmt (siehe
Abbildung 5).
Abbildung 5: Genotypisierung von vldlr -/-, apoER2 -/- und rl -/- Mäusen mittels
Polymerasekettenreaktion (PCR).
Der Genotyp jeder Maus wurde mittels PCR bestimmt. Ethidiumbromid gefärbte Agarosegele
von vldlr -/- (a), apoER2 -/- (b) und reeler (c) Mäusen sind abgebildet. Bei vldlr -/- Mäusen wird
die obere Bande (400 Basenpaare) vom Gen des VLDL-Rezeptors amplifiziert, die untere Bande
(200 Basenpaare) von einer künstlich eingesetzten Neokassette, die in das Exon 5 des VLDLR
Gens eingesetzt wurde, was zu einer Leserastermutation geführt hat (Frykman et al., 1995).
Ebenso verhält es sich bei apoER2 -/- Mäusen: die obere Bande (520 Basenpaare) wird vom
Gen des ApoER2-Rezeptors amplifiziert, die untere (420 Basenpaare) von einer Neokassette.
II-2 Tracer Injektionen
Alle Tiere erhielten vor den operativen Eingriffen eine tiefe Anästhesie:
1. Thalamonal (Fentanyl, 0,5 mg/kg Körpergewicht; Droperidol, 16,5 mg/kg
Körpergewicht; intraperitoneal).
2. Dormicum (Midazolam, 0,1 mg/kg Körpergewicht; intraperitoneal)
Nach Überprüfung der Anästhesietiefe wurden die Mäuse in einen stereotaktischen
Apparat (Stoelting Instruments, Illinois, USA) eingespannt, die Schädelkalotte wurde
freipräpariert und der Schädel wurde trepaniert. Die stereotaktischen Koordinaten
wurden dem Atlas von Franklin und Paxinos (Franklin and Paxinos, 1997)
entnommen. Alle Angaben beziehen sich auf den relativen Abstand von Bregma.
•
Koordinaten für Injektionen in den EC: 1 (L–3,5; V–4; AP–4,7), 2 (L–3;
V–4; AP–4,7), 3 (L–3; V–4,6; AP–4,5).
•
Koordinaten für Injektionen in den Hilus: 1 (L–2,25; V-2,5; AP–3,1), 2
(L–2,6; V–3,1; AP–3,5), 3 (L–2,5; V–2,8; AP–3,4), 4 (L–2,3; V–2,6; AP–
3,3).
22
Zur Injektion wurde PHAL (2,5% in 0,1 M PBS, pH 8,0; Vector Laboratories, USA) in
Glaspipetten mit 8-20 µm Öffnungsdurchmesser und 1,5 mm Außendurchmesser
aufgezogen. Die Injektion erfolgte iontophoretisch mit Hilfe einer geeigneten
Iontophoreseeinheit (Midgard iontophoresis pump; Stoelting Instruments). Es wurde
ein 5 µA Strom appliziert, die Elektrode war über einen Silberdraht an die Anode der
Iontophoreseeinheit angeschlossen. Der Strom wurde für 7 Sekunden appliziert,
gefolgt von einer Pause von 7 Sekunden. Die iontophoretische Applikation von PHAL
erfolgte über einen Zeitraum von 12-15 Minuten.
II-3 Gewebegewinnung und Gewebefixierung
Die Tiere wurden vierzehn Tage nach Tracerinjektion mit Nembutal tief
anästhesiert (Pentobarbital, 300 mg/kg Körpergewicht; intraperitoneal), transkardial
mit 0,9% NaCl Lösung zum Ausspülen des Blutes und anschließend mit 4%
Paraformaldehyd (PFA) Lösung in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4; PB) zur Fixation für
12-15 Minuten perfundiert. Daraufhin wurden die Gehirne entnommen und für
weitere 12-18 Stunden in 4% PFA Lösung nachfixiert. Nach der Fixierung wurden die
Gehirne in 4% Agar eingebettet, aufgeblockt und schließlich 50 µm dicke
Frontalschnitte mit einem Vibratom hergestellt. Die Hirnschnitte wurden mehrmals in
PB gewaschen, um ungebundene Reste des Fixativs zu entfernen.
II-4 Immunhistochemie
Für
alle
Färbungen
wurden
die
Schnitte
zunächst
mit
0,3
%
Wasserstoffperoxid (H2O2, in 0,1 M PB) für 10 min inkubiert um die endogen
Peroxidase zu blockieren. Um unspezifische Bindungen zu blockieren inkubierten wir
die Schnitte mit 5% normalem Pferdeserum (NHS, in 0,1 M PB).
II-4-1 Neuronal Nuclei Immunfärbung
Um die Verteilung von Nervenzellen in der Fascia dentata darzustellen,
verwendeten wir einen Antikörper, der spezifisch gegen ein neuronales Kernprotein
(Neuronal Nuclei, NeuN) gerichtet ist (Mullen et al., 1992). Mit dieser Färbung
konnten wir die Zellverteilungsstörungen von Neuronen in den verschiedenen
Mutanten erfassen.
23
Das Gewebe wurde für 24 Stunden bei 4°C mit Maus anti-NeuN (1:1000;
monoclonal, Chemicon, USA), 1% NHS, 0,1% NaN3 in 0,1 M PB inkubiert. Nach
mehrmaligem Waschen in PB wurden die Schnitte für 2 Stunden mit dem
Zweitantikörper (biotiniliertes anti-Maus IgG, 1:200; Linaris), ebenfalls mit 1% NHS in
0,1 M PB, inkubiert.
II-4-2 Calbindin Immunfärbung
Das kalziumbindende Protein Calbindin kann in der Fascia dentata zur
Identifikation von Körnerzellen verwendet werden (Andressen et al., 1993; Sloviter,
1989a). Nur eine verschwindend geringe Zahl an Interneuronen ist in der Fascia
dentata ebenfalls Calbindin immunreaktiv. Im Rahmen unserer Untersuchungen
spielten diese Neurone keine Rolle, weshalb Calbindin als Marker für Körnerzellen
eingesetzt wurde.
Zur Durchführung der Calbindin-Immunfärbung wurden die Schnitte für 24
Stunden bei 4°C mit Maus anti-Calbindin (1:500; monoclonal, Swant, CH), 1% NHS,
0,3% Triton X-100, 0,1% NaN3 in 0,1 M PB inkubiert. Nach mehreren Waschschritten
mit 0,1 M PB wurde das Gewebe für 2 Stunden mit dem Zweitantikörper (biotiniliertes
anti-Maus IgG, 1:200; Linaris), ebenfalls mit 1% NHS in 0,1 M PB inkubiert.
II-4-3 Calretinin Immunfärbung
Das kalziumbindende Protein Calretinin ist ein Markermolekül für Mooszellen.
Diese Zellen bilden den größten Teil der assoziativen und kommissuralen Axone zur
inneren Molekularschicht der Fascia dentata (Blasco-Ibanez and Freund, 1997). Die
Calretinin-Immunfärbung wurde daher - zusätzlich zur anterograden Markierung mit
PHAL - zur Darstellung der kommissuralen und assoziativen Faserbahn verwendet.
(Fujise et al., 1998)
Das Gewebe wurde 48 Stunden lang bei 4°C mit Kaninchen anti-Calretinin
(1:10000; polyclonal, Swant, CH), 1% NHS, 0,3% Triton X-100, 0,1% NaN3 in 0,1 M
PB inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit 0,1 M PB wurden die Schnitte mit
dem Zweitantikörper (biotiniliertes anti-Kaninchen IgG, 1:200; Linaris) inkubiert.
24
II-4-4 Phaseolus vulgaris-Leukoagglutinin Immunfärbung
PHAL
wurde
zur
anterograden
Markierung
der
entorhinalen
und
kommissuralen Faserbahnen zur Fascia dentata eingesetzt (siehe oben). Die
Markierungssubstanz wurde mit einem immunzytochemischen Verfahren im Gewebe
nachgewiesen. Hierzu wurden die Schnitte für 48 h bei 4°C mit biotiniliertem Ziegen
anti-PHAL (1:800; polyclonal, Linaris), 1% NHS, 0,5% Triton X-100, 0,1% NaN3 in 0,1
M PB inkubiert. Ein Zweitantikörper wurde nicht verwendet, da bereits der gegen
PHAL gerichtete Antikörper biotiniliert ist.
II-4-5 Entwicklung
Nach der Inkubation mit dem Erst- bzw. Zweitantikörper wurden die Schnitte
mehrmals mit 0,1 M PB gewaschen und für 2 h mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase
Komplex (1:100; ABC-Elite, Vector Laboratories, USA; in 0,1 M PB) inkubiert. Nach
mehreren Waschschritten mit 0,1 M PB erfolgte die Entwicklung mit Nickel/DAB
Lösung (5-10 min; 0.05% 3,3’-Diaminobenzidin, 0.005% Ammonium-Nickel-Sulfat,
0.006% Cobalt-Chlorid, 0.001% H2O2 in 0,1 M PB), was zu einer tiefblauen Färbung
führte.
II-4-6 Immunfluoreszenzdoppelfärbung
Zur Darstellung des topographischen Verhältnisses von kommissuralen und
assoziativen
Fasern
innerhalb
eines
Schnittes
wurde
eine
Immunfluoreszenzdoppelfärbung für Calretinin (Markierung kommissuraler und
assoziativer Fasern) und Calbindin (Markierung der Körnerzellen) durchgeführt.
Hierzu wurden Schnitte für 24h mit einem Antikörpercocktail aus Kaninchen
anti-Calretinin (1:5000) und Mäuse anti-Calbindin (1:500; beide Antikörper von
Swant, Bellinzona, CH) mit 1% NHS, 0.1% Triton X-100 in 0.1 M PB inkubiert. Nach
mehrmaligem Waschen in 0,1 M PB wurde das Gewebe in Cy2-konjugiertem antiMäuse IgG (1:1000, 2 h, bei Raumtemperatur, in 0.1 M PB; Molecular Probes,
Eugene, OR, U.S.A.) inkubiert, erneut gewaschen und in Cy3- konjugiertem antiKaninchen IgG (1:500, 2 h, bei Raumtemperatur, in 0.1 M PB; Molecular Probes).
25
Nach mehrmaligem Waschen in 0,1 M PB wurden die Schnitte in Moviol (Aventis,
Frankfurt/M.) eingebettet.
II-5 Polymerasekettenreaktion
Die
Polymerasekettenreaktion
(PCR)
wurde
zur
Genotypisierung
der
Mausmutanten verwendet. Bei der Auswahl der Primer und bei der Durchführung der
PCR wurde auf die Empfehlungen der Jackson Laboratories zurückgegriffen (The
Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME und Frykman et al., 1995). Zur Identifizierung
der ApoER2 Mäuse wurden die Primer und das Protokoll entsprechend den von
Trommsdorff und Kollegen beschriebenen Empfehlungen verwendet (Trommsdorff et
al., 1999). Die reeler Mäuse wurden nach dem Protokoll von D’Arcangelo und
Kollegen genotypisiert (Deller et al., 1999b; D'Arcangelo et al., 1996).
II-6 Digitale Bildverarbeitung
Alle Abbildung wurden mit Adobe Photoshop 6.0 ® zusammengestellt. Die
Fluoreszenzbilder wurden mit einer digitalen Kamera (Spot, Visitron, Deutschland)
aufgenommen. Fluoreszenzeinzelbilder des gleichen Schnittes wurden digital
übereinandergelegt. Bis auf die Korrektur von Kontrast und Helligkeit wurden keine
Änderungen an den Bildern vorgenommen.
26
III Ergebnisse
III-1 Verteilung von Nervenzellen in der Fascia dentata
III-1-1 NeuN Immunhistochemie
Die NeuN-Färbung dient zur Darstellung der Nervenzellverteilung (Mullen et
al., 1992). Die Kontrolltiere zeigten die erwartete reguläre Verteilung von
Nervenzellen in der Fascia dentata (Stanfield and Cowan, 1979b) mit einer
dichtgepackten Körnerzellschicht und mehreren größeren Neuronen im Hilus
(Abbildung 6 a). Bei der Mehrzahl der Zellen im Hilus handelt es sich um Mooszellen,
die den Ursprung der C/A Fasern bilden. Nur sehr wenige Zellen sind in der
Molekularschicht zu finden, von denen die meisten GABAerge Interneurone sind.
Die vldlr -/- Tiere zeigen nur eine leicht veränderte Zytoarchitektur (Abbildung
6 b). Die dichte Körnerzellschicht ist wie in Kontrollen vorhanden. Es sind allerdings
einige ektope Körnerzellen unmittelbar unterhalb der Körnerzellschicht zu finden und
eine weitere Gruppe ektoper Neurone findet sich in der inneren Molekularschicht
(Pfeile in 6 b). Bei den meisten dieser Zellen dürfte es sich ebenfalls, der Größe Ihres
Zellkerns nach, um Körnerzellen handeln.
Die zytoarchitektonischen Veränderungen der apoER2 -/- Tiere sind deutlicher
zu sehen. Es finden sich viele ektope Neurone im Hilus und die Körnerzellschicht ist
weniger deutlich abgrenzbar (Abbildung 6 c). Viele der ektopen Neurone sind
Körnerzellen. Verglichen mit vldlr -/- Mäusen scheinen sich weniger ektope Zellen in
der Molekularschicht zu finden.
Die reeler Mäuse zeigen die stärksten Veränderungen der Zytoarchitektur.
Eine Körnerzellschicht ist nicht mehr erkennbar und das Zentrum der Fascia dentata
ist mit Neuronen bedeckt (Abbildung 6 d). Außerdem finden sich zahlreiche
Nervenzellen in der Molekularschicht. Bei diesen ektopen Zellen handelt es sich, der
Größe und Form ihres Zellkerns nach, um Körnerzellen.
27
Abbildung 6: Verteilung von Neuronen in der Fascia dentata von vldlr -/-, apoER2 -/- und rl -/Mäusen (NeuN Immunhistochemie).
a:
Die Zytoarchitektur der Fascia dentata in einem Kontrolltier. Die normale Zellverteilung
ist zu sehen: die Körnerzellen sind in der Körnerzellschicht (KZS) dichtgepackt. Nur wenige
Neurone sind in der Molekularschicht (MS) oder dem Hilus (H) zu sehen.
b:
In vldlr -/- Mäusen ist die normale Zytoarchitektur weitgehend erhalten. Falsch
positionierte Neurone finden sich in der Molekularschicht (Pfeile) und dem Hilus. Eine
dichtgepackte Körnerzellschicht ist vorhanden.
c:
Die Zytoarchitektur von apoER2 -/- Mäusen ist im Vergleich zur Zytoarchitektur von
vldlr -/- Mäusen stärker beeinträchtigt. Der Hilus ist gefüllt mit falsch positioniert Neuronen
(Stern) und die Körnerzellschicht ist weniger dicht gepackt.
d:
Die Fascia dentata einer rl -/- Maus. Neurone sind über das gesamte Zentrum der Fascia
dentata verteilt (Stern). Zusätzlich finden sich mehr Neurone in der Molekularschicht. Eine
kompakte Körnerzellschicht ist nicht mehr erkennbar.
Eichstriche: a-d: 150 µm.
III-1-2 Calbindin Immunhistochemie
Während NeuN
in allen
Neuronen zu finden ist, findet
sich
das
kalziumbindende Protein Calbindin überwiegend in Körnerzellen der Fascia dentata
(Sloviter, 1989a; Baimbridge et al., 1982; zur Übersicht: Freund and Buzsàki, 1996).
Um die Verteilung der Körnerzellen genauer zu charakterisieren, wurde in einem
zweiten Schritt die Verteilung Calbindin-positiver Neurone in der Fascia dentata der
Kontrolltiere und Mutanten untersucht.
28
In Kontrolltieren sieht man die normale Verteilung Calbindin-positiver Zellen:
viele gefärbte Zellen finden sich in der Körnerzellschicht, während im Hilus nur
wenige Calbindin-haltige Zellen zu finden sind (Abbildung 7 a). CalbindinImmunreaktivität ist im Hilus mit den Axonen der Körnerzellen assoziiert, den
Moosfasern (Projektion der Körnerzellen zu den Pyramidenzellen in CA3; zur
Übersicht: Amaral and Witter, 1995). Calbindin-positive Dendriten der Körnerzellen
sind in der Molekularschicht nachweisbar.
In vldlr -/- sieht man, wie in der NeuN-Färbung, nur eine geringgradige
Störung der Zytoarchitektur. Die stark Calbindin-haltige Körnerzellschicht ist deutlich
erkennbar (Abbildung 7 b). Einige Calbindin-positive Zellen sind im Hilus direkt unter
der Körnerzellschicht zu finden. Diese falsch positionierten Körnerzellen scheinen
jedoch Ihre Polarität beizubehalten und ihre Dendritenbäume in die Körnerzellschicht
zu richten. Außerdem gibt es mehrere Calbindin-immunreaktive Zellen in der
Molekularschicht.
Die Zahl der Calbindin-haltigen Körnerzellen im Hilus ist bei apoER2 -/Mäusen verglichen mit Kontrolltieren und vldlr -/- Mäusen deutlich größer (Abbildung
7 c). Außerdem haben diese Körnerzellen Ihre Polarität verloren. Ihre Dendriten
verzweigen sich im Hilus und scheinen ungerichtet zu sein.
Wie schon die NeuN Färbung vermuten ließ, ist die Körnerzellektopie bei
reeler Mäusen am stärksten ausgeprägt (Abbildung 7 d). Das gesamte Zentrum der
Fascia dentata ist mit Calbindin-positiven Körnerzellen ausgefüllt, deren Dendriten
ein dichtes Netz in der desorganisierten Körnerzellzone bilden. Da bei reeler Mäusen
eine Körnerzellschicht nicht mehr identifiziert werden kann, wird im Folgenden der
Begriff Körnerzellzone verwendet. Damit ist der zentrale Bereich der Fascia dentata
gemeint, der bei reeler Mäusen von Körnerzellen bedeckt ist.
29
Abbildung 7: Calbindin-positive Körnerzellen in der Fascia dentata von vldlr -/-, apoER2 -/- und
rl -/- Mäusen.
a:
Ausschnitt der Fascia dentata eines Kontrolltieres. Die Zellkörper von Körnerzellen in
der Körnerzellschicht (KZS) sind stark angefärbt. Der Hilus (H) enthält nur sehr wenige
Calbindin-positive Zellen. Calbindin-Immunreaktivität ist im Hilus mit Calbindin-positiven
Moosfasern assoziiert.
b:
Verglichen mit Kontrollen zeigt die Fascia dentata von vldlr -/- Tieren nur leichte
Veränderungen. Falsch positionierte Körnerzellen finden sich unterhalb der KZS (Pfeile) und
oberhalb (offene Pfeile, vergleiche mit Abbildung 4 b).
c:
In der Fascia dentata von apoER2 -/- Mäusen finden sich viele Calbindin-positive
Körnerzellen im Hilus (Pfeile). Die Calbindin-positiven Dendriten dieser Körnerzellen
(Pfeilspitzen) sind ohne erkennbare Ordnung im ganzen Hilus zu finden.
d:
In rl -/- Mäusen ist der ganze Hilus mit Calbindin-positiven Körnerzellen übersäht
(Pfeile). Deren Dendriten bilden ein dichtes Netz in der gesamten Körnerzellzone (Pfeilspitzen).
Eichstriche: a-d: 15 µm.
30
III-2 Die Termination entorhinaler Fasern erfolgt
schichtenspezifisch
Zur Aufklärung der Termination entorhinaler Fasern wurden die Fasern des
Tractus perforans, also die Projektionsbahn von EC zur Fascia dentata mit dem
anterograden Tracer PHAL markiert. In Kotrolltieren beobachteten wir ein normales
Terminationsmuster: entorhinale Fasern enden in der äußeren Molekularschicht an
den distalen Abschnitten der Körnerzelldendriten (Deller et al., 1999a; Stanfield et al.,
1979) (Abbildungen 8 a-c). Die Fasern bilden eine scharfe Grenze zur inneren
Molekularschicht. Im Hilus finden sich nur sehr wenige Fasern (Deller, 1998).
Dieses Muster bleibt in vldlr -/- (Abbildungen 4 d-f) und apoER2 -/(Abbildungen 8 g-i) Mäusen erhalten. Entorhinale Fasern enden in den äußeren zwei
Dritteln der Molekularschicht und bilden einen dichten Faserplexus mit einer scharfen
Grenze zur inneren Molekularschicht. Im Hilus finden sich nur wenige Fasern.
Auch
in
reeler
Mäusen
bleibt
das
geschichtete
Terminationsmuster
entorhinaler Fasern erhalten. Wiederum lässt sich ein dichter entorhinaler
Faserplexus in der äußeren Molekularschicht nachweisen. Diese Fasern bilden eine
scharfe Grenze zur benachbarten Körnerzellzone (Abbildungen 8 j-l). Leichte
Veränderungen der Termination entorhinaler Fasern sind jedoch in früheren Studien
bereits beschrieben worden und konnten von uns bestätigt werden (Borrell et al.,
1999; Deller et al., 1999a; Stanfield et al., 1979). Zum einen scheint der entorhinale
Faserplexus in reeler Mäusen weniger dicht zu sein und die Grenze zur inneren
Molekularschicht erscheint etwas weniger scharf als in Kontrollen. Zum anderen
finden sich auf einigen Schnitten band- oder zungenartige Fortsätze des entorhinalen
Faserplexus, die in den Hilus der Fascia dentata hineinreichen. Diese Erweiterungen
des entorhinalen Faserplexus sind gegenüber den benachbarten Gebieten scharf
abgegrenzt (Stanfield et al., 1979). Zum gegenwärtigen Zeitpunkt gibt es für diese
Veränderungen der entorhinalen Terminationszone in reeler Mäusen noch keine
zufriedenstellende Erklärung.
31
Abbildung 8
32
Abbildung 8: Afferenzen aus der entorhinalen Rinde terminieren schichtenspezifisch in der
Fascia dentata von vldlr -/-, apoER2 -/- und rl -/- Mäusen.
a-c:
Anterogrades Tracing mit Phaseolus vulgaris-Leukoagglutinin zeigt das
schichtenspezifische Terminationsmuster in einem Kontrolltier. Zu sehen sind die Fascia
dentata (a), die Molekularschicht (b) und der Hilus (c). Markierte Fasern sieht man in den
äußeren zwei Dritteln der Molekularschicht (äußere Molekularschicht; ÄMS). Die entorhinalen
Fasern bilden einen dichten Plexus mit scharfer Grenze (Pfeil in b) zur inneren
Molekularschicht (IMS). Nur wenige Fasern sind im Hilus (H; Pfeilspitze in c) zu finden.
d-f:
Entorhinale Fasern in der Fascia dentata (d), der Molekularschicht (e) und dem Hilus (f)
von vldlr -/- Tieren. Verglichen mit Kontrolltieren ist das Terminationsmuster sehr ähnlich. Die
scharfe Grenze zwischen markierten entorhinalen Fasern und der inneren Molekularschicht
(Pfeil in e) ist erhalten und es finden sich nur wenige Fasern im Hilus (Pfeilspitze in f).
g-i:
Entorhinale Fasern in der Fascia dentata (g), der Molekularschicht (h) und dem Hilus (i)
von apoER2 -/- Tieren. Die schichtenspezifische Termination bleibt erhalten ebenso wie die
scharfe Grenze zur inneren Molekularschicht (Pfeil in h). Nur wenige Fasern finden sich im
Hilus (Pfeilspitze in i).
j-l:
Entorhinale Fasern in der Fascia dentata (j), der Molekularschicht (k) und dem Hilus (l)
von reeler (rl -/-) Mäusen. Trotz vieler falsch positionierter Körnerzellen bleibt das
grundsätzliche Terminationsmuster entorhinaler Fasern erhalten (j). Beachte die nach wie vor
erhaltene scharfe Grenze zwischen dem entorhinalen Faserplexus und der Körnerzellzone
(Pfeil in k). Im Hilus hingegen finden sich verglichen zu Kontrollen viele Fasern (Pfeilspitze in
l).
Eichstriche: a, d, g und j: 150 µm; b, e, h und k: 30 µm; c, f, i und l: 50 µm.
III-3 Die kommissurale Projektion
Zur Darstellung der kommissuralen Projektion wurde PHAL in den
kontralateralen Hilus injiziert. Dort wurde der Tracer von den Ursprungszellen der
kommissuralen Fasern aufgenommen und über die hippokampale Kommissur in den
kontralateralen Hippokampus transportiert. In Kontrolltieren (Abbildungen 9 a-c)
enden die kommissuralen Fasern überwiegend geschichtet im inneren Drittel der
Molekularschicht (Deller et al., 1999a; Stanfield et al., 1979; Blackstad, 1956; zur
Übersicht: Deller, 1998 und Amaral and Witter, 1995). Diese Fasern bilden einen
dichten Plexus, der gegenüber der äußeren Molekularschicht scharf abgegrenzt ist.
Eine geringere Zahl kommissuraler Fasern verhält sich jedoch anders und endet
auch in Kontrolltieren in der äußeren Molekularschicht. Diese Fasern durchqueren
den kommissuralen Faserplexus in der inneren Molekularschicht und verzweigen in
der äußeren Molekularschicht. Es wird vermutet, dass es sich bei diesen
kommissuralen Fasern zur äußeren Molekularschicht um die Axone kommissural
projizierender GABAerger Neurone im Hilus handelt (Zappone and Sloviter, 2001;
Deller et al., 1999a; Deller et al., 1995). Im Hilus finden sich vereinzelte
kommissurale Fasern, die den Hilus mehr oder weniger gradlinig durchqueren, um
bis in die Molekularschicht der Fascia dentata zu ziehen. Diese kommissuralen
33
Fasern verzweigen nur selten und bilden nur vereinzelte en passant Boutons (Deller
et al., 1995).
Das Terminationsmuster kommissuraler Fasern bleibt in vldlr -/- Mäusen
erhalten (Abbildungen 9 d-f). Der Großteil der kommissuralen Fasern bildet einen
dichten Plexus in der inneren Molekularschicht und man findet einzelne
kommissurale Fasern in der äußeren Molekularschicht. Im Gegensatz zu
Kontrolltieren beobachtet man in vldlr -/- Mäusen jedoch eine vermehrte Zahl an
kommissuralen
Fasern
im
Hilus,
insbesondere
unmittelbar
unterhalb
der
Körnerzellschicht. Die Betrachtung einzelner kommissuraler Axone zeigte, dass es
sich bei diesen Fasern mit großer Wahrscheinlichkeit um Axonkollateralen
kommissuraler Axone handelt, die bis zur inneren Molekularschicht ziehen. Diese
Axonkollateralen verzweigen sich direkt unterhalb der Körnerzellschicht, in
topographischer Beziehung zu den dort vorhandenen ektopen Körnerzellen.
Das Terminationsmuster in apoER2 -/- Mäusen ist gegenüber Kontrollen noch
deutlicher verändert (Abbildungen 9 g-i). In der inneren Molekularschicht findet sich
zwar noch ein Faserplexus, jedoch erscheint die Abgrenzung dieses Faserplexus zur
Körnerzellschicht unscharf. Die Grenze zur äußeren Molekularschicht ist nach wie
vor scharf ausgebildet. Im Hilus und in der aufgelockerten Körnerzellschicht findet
man
zahlreiche
kommissurale
Fasern,
wobei
die
Fasern
im
Hilus
viele
Verzweigungen und Boutons ausbilden.
Die kommissurale Projektion von reeler Mäusen wurde bereits detailliert
beschrieben (Borrell et al., 1999; Deller et al., 1999a; Stanfield et al., 1979) und diese
früheren Ergebnisse konnten in der vorliegenden Untersuchung bestätigt werden
(Abbildungen 9 j-l). So fanden wir keinen abgrenzbaren kommissuralen Faserplexus
mehr, lediglich eine gewisse Präferenz kommissuraler Fasern für die Zone direkt
oberhalb der Körnerzellen konnte beobachtet werden. Die meisten kommissuralen
Fasern enden in der Körnerzellzone, wo sie ein dichtes Netzwerk bilden. Ebenso wie
bei allen anderen untersuchten Mausstämmen findet man bei reeler Mäusen
kommissurale Fasern in der äußeren Molekularschicht.
34
Abbildung 9
35
Abbildung 9: Die geschichtete Termination kommissuraler Fasern ist in vldlr -/-, apoER2 -/- und
rl -/- Mäusen gestört.
a-c:
Anterogrades Tracing mit Phaseolus vulgaris-Leukoagglutinin zeigt die geschichtete
Termination kommissuraler Fasern in Kontrolltieren (+/+). Fascia dentata (a), der
Molekularschicht (b) und dem Hilus (c). Kommissurale Fasern bilden einen dichten
Faserplexus (Pfeil in b) in der inneren Molekularschicht (IMS). Einige Fasern finden sich in der
äußeren Molekularschicht (ÄMS; Pfeilspitze in b). Der Hilus (H) wird von Fasern gekreuzt
(Pfeilspitze in c), die auf dem Weg zur Molekularschicht sind. KZS, Körnerzellschicht.
d-f:
Das Terminationsmuster kommissuraler Fasern ist leicht verändert in der Fascia
dentata (d), der Molekularschicht (e) und dem Hilus (f) von vldlr -/- Mäusen. Der dichte
Faserplexus in der inneren Molekularschicht ist erhalten (Pfeil in e). Mehrere kommissurale
Fasern sind in der äußeren Molekularschicht (Pfeilspitze in e) zu finden. Im Gegensatz zu
Kontrollen finden sich mehrere kommissurale Fasern direkt unterhalb der Körnerzellschicht
(Pfeilspitzen in d), wo sie sich verzweigen und Kollateralen bilden.
g-i:
Die Termination kommissuraler Fasern ist in der Fascia dentata (g), der
Molekularschicht (h) und dem Hilus (i) von apoER2 -/- Tieren verändert. Der Faserplexus in der
inneren Molekularschicht (Pfeil in h) ist weniger gut abgrenzbar. Mehrere kommissurale Fasern
finden sich in der äußeren Molekularschicht (Pfeilspitze in h). Im Hilus finden sich viele Fasern
(Pfeilspitzen in i) die sich dort verzweigen und Terminalen bilden.
j-l:
In rl -/- Mäusen ist die Termination kommissuraler Fasern in der Fascia dentata (j), der
Molekularschicht (k) und dem Hilus (l) stark verändert. Obwohl die Fasern immer noch die
Zone direkt über der Körnerzellzone bevorzugen (Pfeil in k), wird keine kompakte Faserschicht
gebildet. Kommissurale Fasern finden sich in der äußeren Molekularschicht (Pfeilspitze in k).
Der Hilus ist voll mit kommissuralen Fasern (Pfeilspitze in l), die Faszikel und einen lockeren
Plexus bilden.
Eichstriche: a, d, g und h: 100 µm; b, e, h und k: 50 µm; c, f, i und l: 30 µm.
III-4 Calretinin-Immunhistochemie zeigt eine veränderte
Termination kommissural/assoziativer Mooszellaxone in
vldlr -/-, apoER2 -/- und rl -/- Mäusen
Mooszellaxone bilden den größten Teil der kommissuralen und assoziativen
Fasern zur inneren Molekularschicht (zur Übersicht: Deller, 1998 und Amaral and
Witter, 1995). Diese Zellen enthalten in der Maus das kalziumbindende Protein
Calretinin,
wodurch
man
Mooszellen
und
Mooszellaxone
in
der
Maus
immunzytochemisch gut detektieren kann (Fujise et al., 1998; Blasco-Ibanez and
Freund, 1997; Liu et al., 1996). Während die PHAL-Markierung alle kommissuralen
Fasern darstellt, lässt sich mittels Calretinin-Immunhistochemie eine neurochemisch
definierte Untergruppe des kommissuralen/assoziativen Fasersystems markieren
und in den Mutanten untersuchen.
36
Abbildung 10
37
Abbildung 10: Calretinin-Immunhistochemie zeigt Mooszellen und Cajal-Retzius Zellen in
vldlr -/-, apoER2 -/- und rl -/- Mäusen.
a-d:
Calretinin Färbung in der Fascia dentata (a), der Molekularschicht (b, c) und dem Hilus
(d) eines Kontrolltieres. Mehrere Calretinin-positive Mooszellen sind im Hilus (H) vorhanden.
Die Axone dieser Zellen bilden den kommissural/assoziativen Faserplexus in der inneren
Molekularschicht (IMS). In der äußeren Molekularschicht (ÄMS) finden sich einige Cajal-Retzius
Zellen nahe der hippokampalen Fissur (c). Nur wenige Calretinin-positive puncta sind im Hilus
zu finden (d). KZS, Körnerzellschicht.
e-h:
Calretinin in der Fascia dentata (e), der Molekularschicht (f, g) und dem Hilus (h) einer
vldlr -/- Maus. Mooszellen und Cajal-Retzius Zellen finden sich im Hilus (e, h), beziehungsweise
in der Nähe der hippokampalen Fissur (g). Ein dichter Calretinin-positiver Plexus findet sich in
der inneren Molekularschicht (Pfeil in f). Verglichen mit Kontrollen sieht man viele Calretininpositive puncta direkt unterhalb der Körnerzellschicht.
i-l:
Calretinin in der Fascia dentata (i), der Molekularschicht (j, k) und dem Hilus (l) von
apoER2 -/- Mäusen. Mooszellen finden sich zwischen falsch positionierten Körnerzellen (i).
Mehrere Cajal-Retzius Zellen sieht man an Ihrer normalen Lokalisation in der Nähe der
hippokampalen Fissur (k). Zusätzlich zu dem dichten Calretinin-positiven Plexus in der inneren
Molekularschicht (Pfeil in j) gibt es viele Calretinin-positive puncta im Hilus (l).
m-p: Calretinin in der Fascia dentata (m), der Molekularschicht (n, o) und dem Hilus (p) von
reeler (rl -/-) Mäusen. Mooszellen sieht man in der Körnerzellzone (m) und mehrere CajalRetzius Zellen finden sich nahe der hippokampalen Fissur (o). Der Hilus enthält zahlreiche
Calretinin-positiven puncta (p). Obwohl kein gut erkennbarer Calretinin-positiver Plexus
vorhanden ist, bilden Calretinin-positive Fasern eine Grenze zur äußeren Molekularschicht
(Pfeil in n).
Eichstriche: a, e, i, m: 100 µm; b, f, j, n: 50 µm; c, g, k, o: 5 µm; d, h, l, p: 30 µm.
In Kontrolltieren (Abbildungen 10 a-d) lassen sich zahlreiche Calretininpositive Mooszellen im Hilus nachweisen. Ebenso ist die innere Molekularschicht
Calretinin-immunreaktiv; dort enden die kommissural/assoziativen Mooszellaxone. Im
Hilus finden sich nur wenige Calretinin-positive puncta, was dafür spricht, dass nur
wenige kommissurale/assoziative Mooszellaxone im Hilus von Kontrollmäusen zu
finden sind.
In vldlr -/- Mäusen (Abbildungen 10 e-h) findet sich ebenfalls ein dichter
Calretinin-positiver Plexus in der inneren Molekularschicht; Calretinin-positive
Mooszellen sind im Hilus nachweisbar. Verglichen mit Kontrolltieren finden sich
jedoch
mehr
Calretinin-positive
puncta
im
Hilus,
direkt
unterhalb
der
Körnerzellschicht, also dort, wo man auch mit Hilfe des anterograden Tracings einen
dünnen Faserplexus nachweisen kann.
Die Veränderungen bei apoER2 -/- Mäusen sind ausgeprägter (Abbildungen
10 i-l). Calretinin-positive Mooszellen finden sich inmitten ektoper Körnerzellen und
der Hilus ist mit Calretinin-positiven puncta bedeckt.
38
Reeler Mäuse zeigen die offensichtlichsten Veränderungen in der Verteilung
der Calretinin Immunreaktivität (Abbildungen 10 m-p). Mooszellen sind über die
ganze Körnerzellzone verteilt und der Calretinin-positive Faserplexus oberhalb der
Körnerzellen ist nicht sicher abgrenzbar. Nur unmittelbar oberhalb der Körnerzellen
findet sich eine erhöhte Dichte Calretinin-positiver Fasern. Die meisten Calretininpositiven Fasern enden jedoch in der Körnerzellzone und dort finden sich auch sehr
viele Calretinin-positiven puncta.
III-5 Calretinin- / CalbindinDoppelimmunfluoreszenzfärbungen bestätigen die
räumliche Assoziation Calbindin-positiver Körnerzellen
und Calretinin-positiver kommissural/assoziativer Fasern
In Kontrolltieren bestätigt die Doppelimmunfluoreszenz die Assoziation von
Körnerzellen der Fascia dentata und kommissural/assoziativen Fasern (Abbildung 11
a). Die Körnerzellschicht besteht aus stark Calbindin-positiven, dicht gepackten
Körnerzellen, deren Dendriten in die Molekularschicht ragen (Abbildung 11 e). Der
Großteil Calretinin-positiver Boutons befindet sich an Körnerzelldendriten in der
inneren Molekularschicht (Abbildung 11 e).
Auch in vldlr -/- Mäusen besteht die Körnerzellschicht aus Calbindin-positiven,
dicht aneinander liegenden Körnerzellen (Abbildung 11 b). Direkt unterhalb der
Körnerzellschicht findet sich eine leichte Zuname der Calretinin-Immunreaktivität
(Abbildung 11 f), also dort wo man in der PHAL Färbung einen feinen Faserplexus
findet. In der inneren Molekularschicht sieht man mehrere Calretinin-positive Boutons
an Calbindin-positiven Körnerzellsomata oder –dendriten (Abbildungen 11 b, 11 f).
Die Veränderungen in apoER2 -/- Mäusen sind stärker. Der Hilus enthält viele
Calbindin-positive Körnerzellen, deren Dendriten teilweise Ihre Polarität verloren
haben (Abbildungen 11 c, 11 g). Auch die Calretinin-Immunreaktivität ist im Hilus
stärker ausgeprägt und dort um die falsch positionierten Körnerzellen konzentriert
(Abbildungen 11 c, 11 g).
39
Abbildung 11: Immunfluoreszenzdoppelfärbung für Calretinin (kommisural/assoziative Fasern;
rot) und Calbindin (Körnerzellen; grün)
a:
Immunfluoreszenzdoppelfärbung für Calretinin und Calbindin in einem Kontrolltiere
(+/+). Calretinin positive Fasern finden sich vor allem in der inneren Molekularschicht (IMS). Im
Hilus (H) gibt es wenige Calretinin-immunreaktive Zellen. Höhere Vergrößerung eines
Ausschnittes in e. Körnerzellschicht, KZS; äußere Molekularschicht, ÄMS.
b:
Immunfluoreszenzdoppelfärbung für Calretinin und Calbindin in einem vldlr -/- Tier.
Calretinin positive Fasern finden sich in der IMS und unterhalb der KZS. Höhere Vergrößerung
eines Ausschnittes in f.
c:
Immunfluoreszenzdoppelfärbung für Calretinin und Calbindin in einer apoER2 -/- Maus.
Calretinin positive Fasern finden sich im Hilus, der KZS und der Molekularschicht. Höhere
Vergrößerung eines Ausschnittes in g.
40
d:
Immunfluoreszenzdoppelfärbung für Calretinin und Calbindin in einer reeler (rl -/-)
Maus. Calretinin-positive Fasern finden sich in der gesamten Körnerzellzone. Höhere
Vergrößerung eines Ausschnittes in h.
e:
Höhere Vergrößerung von a. Man sieht Calretinin-positive Boutons direkt neben
Calbindin-positiven Körnerzelldendriten in der IMS.
f:
Höhere Vergrößerung von b. Man sieht Calretinin-positive Boutons direkt neben
Calbindin-positiven Körnerzelldendriten oder falsch positionierten Körnerzellen in der IMS
(Pfeil). Einige Boutons finden sich unterhalb der KZS (Pfeilspitze).
g:
Höhere Vergrößerung von c. Falsch positionierte Calbindin-positive Körnerzellen (Pfeil)
oder ihre Dendriten sind von Calretinin-positiven puncta umgeben.
h:
Höhere Vergrößerung von d. Calretinin-positive puncta umgeben falsch positionierte
Calbindin-positive Körnerzellen.
Eichstriche: a-d: 100 µm; e-h: 20 µm.
Am ausgeprägtesten sind die Veränderungen in reeler Mäusen. Die
Körnerzellen sind nicht mehr in einer Schicht organisiert und Ihre Dendriten zeigen in
alle Richtungen (Abbildungen 11 d, 11 h). Die Calretinin-Immunreaktivität zeigt eine
leichte Präferenz für den Bereich oberhalb der Körnerzellzone, ist jedoch auch im
Hilus stark ausgeprägt (Abbildung 11 d). Die direkte Assoziation von Calretininpositiven Boutons direkt an falsch positionierten Calbindin-positiven Körnerzellen
oder deren Dendriten ist gut erkennbar (Abbildung 11 h).
III-6 Calretinin-positive Cajal-Retzius Zellen in vldlr -/-,
apoER2 -/- und rl -/- Mäusen
Calretinin ist auch ein Molekül für Cajal-Retzius Zellen in der Fascia dentata
der Maus (Alcantara et al., 1998; Liu et al., 1996; Del Rio et al., 1995). In
Kontrolltieren (Abbildung 10 c), vldlr -/- (Abbildung 10 g), apoER2 -/- (Abbildung 10 k)
und rl -/- Mäusen (Abbildung 10 o) findet man Cajal-Retzius Zellen an Ihrer normalen
Position nahe der hippokampalen Fissur. Diese Zellen sind klein, horizontal orientiert
und von ovaler Gestalt. Sie geben einen Dendriten ab, der parallel zur
hippokampalen Fissur verläuft (Drakew et al., 1998; Liu et al., 1996; Del Rio et al.,
1995; Soriano et al., 1994; VonHaebler et al., 1993). In erwachsenen Kontrolltieren
findet man nur wenige dieser Zellen, da die Mehrheit dieser Neurone nur
vorübergehend vorhanden ist und in den ersten Wochen nach Geburt verschwindet
(Marin-Padilla, 1998; Del Rio et al., 1997; Soriano et al., 1994). In erwachsenen
reeler Mäusen schien die Anzahl vorhandener Cajal-Retzius Zellen jedoch größer zu
sein (Deller et al., 1999a), was kürzlich mit Hilfe stereologischer Zählverfahren
41
bewiesen wurde (Coulin et al., 2001). In vldlr -/- und apoER2-/- Mäusen konnten wir
keine offensichtlich erhöhte Anzahl von Cajal-Retzius Zellen beobachten. Eine
genaue Aussage ließe sich jedoch nur mit Hilfe einer stereologischen Zellzählung
machen.
42
IV Diskussion
In dieser Studie wurde die Frage gestellt, inwiefern die Schichtung afferenter
Fasersysteme im Hippokampus von einer normalen Zytoarchitektur abhängt. Hierzu
wurden Mausmutanten (vldlr -/-, apoER2 -/- und rl -/- Mäuse) untersucht, bei denen
Gendefekte im Reelin-Signaltransduktionsweg zu charakteristischen Störungen der
Körnerzellmigration geführt haben. Die Störungen in der Körnerzellverteilung wurden
mit der Termination zweier geschichteter Fasersysteme, den entorhinalen und den
kommissural/assoziativen
Afferenzen,
korreliert.
Es
zeigte
sich,
dass
die
geschichtete Termination der entorhinalen Fasern nicht von der Körnerzellverteilung
abhängt, da diese Fasern auch in den Mutanten in ihrer normalen Schicht enden. Im
Gegensatz hierzu ist die geschichtete Termination der kommissuralen Fasern von
der Körnerzellverteilung abhängig, da die geschichtete Termination kommissuraler
Fasern in den Mutanten aufgehoben ist. Diese Daten stützen die Hypothese, dass
bislang noch unbekannte molekulare Signale auf den Körnerzellen der Fascia
dentata die schichtenspezifische Termination der kommissuralen und assoziativen
Fasern regulieren.
IV-1 Kritische Betrachtung der verwendeten Methoden
Um die Verteilung der zwei Hauptafferenzen zum Hippokampus mit der
Verteilung der Körnerzellen zu vergleichen, müssen sowohl die afferenten
Faserbahnen als auch die Körnerzellen sicher identifizieren werden.
Die Markierung der Fasertrakte erfolgte im Rahmen unserer Experimente mit
Hilfe der hochauflösenden und sehr sensitiven anterograden Markierungssubstanz
PHAL, die seit längerem mit guten Ergebnissen im neurowissenschaftlichen Bereich
eingesetzt wird (Deller et al., 2000; Deller et al., 1999b; Deller, 1998; Frotscher et al.,
1997; Pinault, 1996; Deller et al., 1995; Gerfen and Sawchenko, 1984). Von einer
sicheren Identifizierung der Faserbahnen mit Hilfe dieser Substanz kann daher
ausgegangen werden.
Zur Identifikation von Körnerzellen verwendeten wir das kalziumbindende
Protein Calbindin. Dieses Molekül ist in der Fascia dentata der Maus sowohl in
43
Körnerzellen als auch in Interneuronen nachweisbar (Baimbridge et al., 1992;
Sloviter, 1989b; Baimbridge and Miller, 1982; zur Übersicht: Freund and Buzsàki,
1996). Es stellt sich somit die Frage, ob Calbindin im Rahmen unserer
Untersuchungen als ein hinreichend spezifischer Körnerzellmarker angesehen
werden kann. Zwei Gründe legen dies nahe: (1) In der Fascia dentata ist die Zahl der
Calbindin-positiven Interneurone sehr gering (Baimbridge and Miller, 1982). Da die
Zahl
der
Calbindin-positiven
Körnerzellen
die
Zahl
der
Calbindin-positiven
Interneurone um ein Vielfaches übersteigt, kann die geringe Zahl Calbindin-positiver
Interneurone im Rahmen der hier durchgeführten Untersuchung vernachlässigt
werden. (2) Die Körnerzellen besitzen eine sehr charakteristische Größe und Form.
Dadurch können sie aufgrund ihrer morphologischen Eigenschaften leicht identifiziert
(z.B. großer runder Zellkern, Durchmesser des Somas gering, weniger als 10 µm)
und von Calbindin-positiven Interneuronen (unregelmäßig geformter Zellkern,
Somadurchmesser. meist deutlich größer als 10µm) unterschieden werden
(Frotscher,
1988).
Wir
sind
daher
davon
überzeugt,
dass
Calbindin
als
Körnerzellmarker in der Fascia dentata sinnvoll eingesetzt werden kann.
Ein zweiter methodischer Aspekt betrifft die qualitative Natur der hier
durchgeführten Untersuchungen. Zur Beantwortung unserer Fragestellung haben wir
zwar das Verteilungsmuster der markierten Fasersysteme mit der Verteilung der
Körnerzellen
verglichen,
quantitative
Aussagen
über
die
untersuchten
Projektionssysteme in den verschiedenen Mutanten aber weitestgehend vermieden.
Dies
hängt
damit
zusammen,
dass
zwischen
einzelnen
Tieren
große
interindividuellen Schwankungen in der Injektionsgröße beobachtet werden. Kleine
Injektionen markieren wenige Fasern, während es nach großen Injektionen zu einer
Markierung von vielen Fasern kommt. Es lassen sich daher mit Hilfe anterograder
Markierungsverfahren bestenfalls semi-quantitative Aussagen zur Mächtigkeit einer
Faserprojektion machen. In den Abbildungen der vorliegenden Arbeit wurden
ausschließlich Hirnschnitte von Tieren abgebildet, deren Injektionsgröße und
Injektionsqualität miteinander vergleichbar gewesen sind.
Es sind seit der Erstbeschreibung des reeler-Phänotyps mehrere Mutationen
im reeler Genlocus beschrieben worden. Die verschiedenen reeler Mutanten wurden
als Inzucht-Stämme gezüchtet, was zur Entstehung von verschiedenen reeler
44
Mauslinien geführt hat. Um nur auf eine dieser Linien einzugehen, sei an dieser
Stelle die Orleans reeler Maus (rlorl) genannt, die noch reelin mRNA (Hirotsune et al.,
1995) und eine mutierte Version des Proteins synthetisieren (205 C-terminale
Aminosäuren fehlen), aber nicht sekretieren kann. Die von uns in dieser Studie
verwendeten reeler Mäuse sind aus den Jackson Laboratories und haben keine
Restaktivität, d.h. reelin mRNA wird nicht mehr synthetisiert (zur Übersicht: Curran
and D´Arcangelo, 1998). Wie bereits in der Einleitung erwähnt sind die Unterschiede
zwischen den verschiedenen reeler Stämmen minimal und vermutlich auf den
unterschiedlichen
genetischen
Hintergrund
zurückzuführen,
da
jedoch
über
Unterschiede zwischen den reeler Stämmen berichtet wurde (Goffinet, 1990), die
eventuell auf einer Restaktivität des mutierten Proteins beruhen könnten, soll an
dieser Stelle betont werden, dass die von uns verwendete Jackson Reeler Maus
keinerlei Reelin Restaktivität besitzt.
IV-2 Die Termination entorhinaler Fasern ist unabhängig
von Reelin und dem Reelin-Rezeptor Komplex
Die Termination entorhinaler Afferenzen zum Hippokampus erfolgt in allen
untersuchten Tieren geschichtet. Auch wenn es kleinere Veränderungen gibt, so
bleibt doch generell das Terminationsgebiet auf die äußere Molekularschicht oder ein
entsprechendes Pendant beschränkt. Auch in Tierstämmen mit vielen ektopen
Körnerzellen, wie zum Beispiel den apoER2 -/- und rl -/- Mäusen, endeten die
entorhinalen Fasern in einem schichtenspezifischen Muster in der äußeren
Molekularschicht der Fascia dentata. Diese Ergebnisse stehen in gutem Einklang mit
früheren Untersuchungen in denen gezeigt wurde, dass entorhinale Fasern
unabhängig von der Position der Körnerzellen dazu in der Lage sind, ihre normale
Terminationsschicht zu finden (Deller et al., 1999a; Del Rio et al., 1997; Stanfield et
al., 1979; Bliss and Chung, 1974). Auch Läsionen der Körnerzellen verschiedenster
Art konnten in normalen Mäusen das Terminationsmuster entorhinaler Fasern nicht
ändern (Legendre et al., 1994; Goldschmidt and Steward, 1992; Tonder et al., 1989;
Zimmer et al., 1986; Laurberg and Hjorth-Simonsen, 1977). Wie in neuen
Untersuchungen gezeigt wurde, sind entorhinale Fasern dazu in der Lage, die
äußere Molekularschicht auch dann noch zu finden, wenn während der Entwicklung
die gesamte Körnerzellschicht fehlt (Schwab et al., 2000). Entorhinale Fasern enden
somit unabhängig von Körnerzellen.
45
Welche
Signale
determinieren
das
schichtenspezifische
Einwachsen
entorhinaler Fasern in die Fascia dentata? In mehreren Studien konnte gezeigt
werden, dass Reelin synthetisierende Cajal-Retzius Zellen für das korrekte
Einwachsen entorhinaler Fasern in die äußere Molekularschicht verantwortlich sind;
(Supèr et al., 1998; Del Rio et al., 1997; zur Übersicht: Frotscher, 1998). Diese Zellen
finden sich während der Entwicklung in der äußeren Molekularschicht und
einwachsende entorhinale Fasern bilden vorübergehend Synapsen mit Ihnen aus,
bevor sie Kontakte mit Ihren endgültigen Zielzellen in der Fascia dentata herstellen.
Da die Axone von Cajal-Retzius Zellen während der Hirnentwicklung zum
entorhinalen Kortex projizieren bevor die entorhinalen Afferenzen zum Hippokampus
einwachsen,
wurde
vorübergehende
vorgeschlagen,
Projektion
als
dass
die
Leitschiene
entorhinalen
benutzen,
Fasern
um
die
diese
äußere
Molekularschicht der Fascia dentata zu erreichen (Ceranik et al., 1999).
Obwohl die molekularen Mechanismen der Interaktion von Cajal-Retzius
Zellen mit entorhinalen Fasern noch nicht bekannt sind, so machen die Ergebnisse
der hier vorliegenden Arbeit deutlich, dass dafür Reelin und der Reelin-Rezeptor
Komplex nicht notwendig sind. Weder die Abwesenheit von Reelin, noch Mutationen
im Reelin-Rezeptor Komplex führten zu einer Störung des normalen Einwachsens
entorhinaler Fasern in die äußere Molekularschicht. In allen Mutanten fanden sich
Calretinin-positive Cajal-Retzius Zellen in der äußeren Molekularschicht, die
entorhinale Fasern dorthin leiten können.
Neue Untersuchungen legen außerdem den Schluss nahe, dass es noch
deutlich mehr Wegfindungssignale für Fasern aus dem EC gibt (zur Übersicht:
Skutella and Nitsch, 2001). Zum Beispiel scheint ephrin-A3 auf Fasern des Tractus
perforans abstoßend zu wirken (Stein et al., 1999). In einer anderen Untersuchung
wurden organotypische Schnittkulturen mit Hyaluronidase behandelt, was sowohl
einen Verlust der schichtenspezifischen Adhäsion als auch einen Verlust des
schichtenspezifischen Wachstums entorhinaler Fasern nach sich zog (Förster et al.,
2001). Die molekularen Interaktionspartner sind zwar noch unbekannt, jedoch lassen
diese Beobachtungen vermuten, dass Hyaluronsäure-assoziierte Moleküle eine
wichtige Rolle für die schichtenspezifische Termination der entorhino-hippokampalen
Projektion spielen.
46
IV-3 Die geschichtete Termination kommissuraler Fasern
hängt von der Anordnung der Körnerzellen ab
Wie mittels anterogradem Tracing und Calretinin Immunhistochemie gezeigt
werden konnte, korreliert die Verteilung kommissuraler/assoziativer Fasern mit der
Verteilung der Körnerzellen in der Fascia dentata. So finden sich in vldlr -/- Mäusen
nur wenige ektope Körnerzellen, vor allem in der inneren Molekularschicht und dem
Hilus. Entsprechend sieht man nach PHAL-Injektion in den kontralateralen Hilus nur
wenige ektope kommissurale Fasern unterhalb der Körnerzellschicht und in der
inneren Molekularschicht, wo sie an den proximalen Dendriten falsch positionierter
Körnerzellen enden (Synopsis siehe Abbildung 12). In apoER2 -/- Mäusen finden
sich viele ektope Körnerzellen im Hilus. Entsprechend sieht das Bild in der Calretininund PHAL-Färbung aus: Zahlreiche PHAL-markierte kommissurale Fasern finden
sich im Hilus, ebenso wie viele Calretinin reaktive puncta (Synopsis siehe Abbildung
12). In rl -/- Mäusen sind die Körnerzellen beinahe zufällig im ganzen Zentrum der
Fascia dentata verteilt, genauso wie die kommissuralen Fasern: PHAL markierte
Fasern bilden ein lockeres Netzwerk in der Mitte der Fascia dentata und Calretininpositive puncta sind in der gesamten Körnerzellzone zu finden (Synopsis siehe
Abbildung 12).
In rl -/- Mäusen findet sich kein abgrenzbarer Plexus kommissuraler Fasern,
ebenso wenig wie man dort eine geordnete Körnerzellschicht erkennen kann.
Hingegen bilden die kommissuralen Fasern in vldlr -/- und apoER2 -/- Tieren noch
einen Plexus aus, genauso wie diese Tiere noch eine geordnete Körnerzellschicht
erkennen lassen.
Die Daten dieser Studie zeigen einen sehr engen Zusammenhang zwischen
der Verteilung der Körnerzellen und dem Terminationsgebiet kommissuraler Fasern
und liefern weitere Unterstützung für die Hypothese, dass Signale auf Körnerzellen
den einwachsenden kommissuralen Fasern als Wegfindungssignale dienen. Unsere
Daten sprechen also gegen die in der Einleitung erwähnte Vermutung, dass
GABAerge
Pionierneurone
den
einwachsenden
kommissuralen
Fasern
als
Leitschiene dienen (Borrell et al., 1999). In dieser Arbeit wurde auch vermutet, dass
kommissurale Fasern in der äußeren Molekularschicht ein Merkmal einer aberranten
kommissuralen Projektion in reeler Mäusen sind. Jedoch konnte bereits vor einiger
47
Zeit demonstriert werden, dass solche Fasern ein normales Merkmal von Nagetieren
sind (Deller et al., 1999a; Deller et al., 1995; diese Studie).
Zusätzlich zu unseren Daten konnte vor kurzem gezeigt werden, dass
GABAerge Interneurone für die geschichtete Termination hippokampaler Afferenzen
nicht erforderlich sind (Pleasure et al., 2000). In Ihrer eleganten Studie stellten
Pleasure und Kollegen Dlx1/2 Mutanten her, denen die GABAerge Zellpopulation im
Hippokampus fehlt, also eben die Zellen, die als Pionierneurone für einwachsende
entorhinale
Fasern
dienen
sollten.
Die
Untersuchung
entorhinaler
und
kommissural/assoziativer Fasern in Dlx1/2 Mäusen zeigte, dass die Afferenzen zum
Hippokampus trotz der Abwesenheit GABAerger Neurone normal enden. Dies zeigt,
dass
GABAerge
Hauptafferenzen
Neurone
zum
nicht
für
Hippokampus
die
nötig
normale
sind.
Entwicklung
Zusammen
mit
der
zwei
unseren
Untersuchungen liegt folglich der Schluß nahe, dass Körnerzellen die nötigen
Signale für einwachsende entorhinale Fasern während der Entwicklung liefern.
48
Abbildung 12: Die Zyto- und Faserarchitektur der Fascia dentata von Kontrolltieren (+/+),
VLDLR- (vldlr -/-), ApoER2 defizienten Mäusen (apoER2 -/-) und reeler Mäusen (rl -/-).
Zusammenfassung der Verteilung von Körnerzellen (KZ), dem Terminationsmuster
kommissuraler Fasern (COM) und dem Terminationsmuster entorhinaler Fasern (EC) in der
Fascia dentata. In Kontrolltieren sind die Körnerzellen in einer dichtgepackten Schicht
organisiert. Dieses Muster ist in vldlr -/- Mäusen leicht, in apoER2 -/- Mäusen etwas mehr und in
rl -/- Mäusen stark gestört. Diese Veränderungen in der Zytoarchitektur werden von der
Verteilung kommissuraler Afferenzen in den drei Mutanten widergespiegelt: ektop endende
Fasern finden sich dort, wo auch ektope KZ zu finden sind. Im Gegensatz dazu wird das
Terminationsmuster entorhinaler Fasern kaum von der gestörten Verteilung der KZ beeinflusst.
Also beeinträchtigt die Fehlverteilung von Körnerzellen in diesen Mutanten die Termination
kommissuraler Fasern, nicht aber die entorhinaler Afferenzen. KZS, Körnerzellschicht; H,
Hilus; IMS, innere Molekularschicht; ÄMS, äußere Molekularschicht; MS, Molekularschicht;
KZZ, Körnerzellzone.
49
IV-4 Die Reelin-Signaltransduktion und die Entwicklung des
Hippokampus
Reeler Mäuse sind seit Jahrzehnten für die Forschung verfügbar und haben
unser Denken über Gene und Moleküle, die die Positionierung während der
Gehirnentwicklung steuern, bestimmt (Rice and Curran, 1999; D'Arcangelo and
Curran, 1998; Rakic and Caviness, 1995). Reelin selbst (D'Arcangelo et al., 1995)
und die Komponenten des Reelin-Rezeptor-Komplexes (Trommsdorff et al., 1999;
Hiesberger et al., 1999; D'Arcangelo et al., 1999; zur Übersicht: Herz, 2001) wurden
erst vor kurzem entdeckt. Interessanterweise führt nur das Fehlen beider Teile des
Reelin-Rezeptor-Komplexes zum reeler Phänotyp (Trommsdorff et al., 1999). Fehlt
entweder der ApoE-Rezeptor 2, oder der VLDL-Rezeptor kommt es zu eigenen, vom
reeler Phänotyp unterschiedlichen morphologischen Defekten (Trommsdorff et al.,
1999; diese Studie). Dies lässt vermuten, dass VLDLR und ApoER2 unterschiedliche
Funktionen in verschiedenen Regionen während der Hirnentwicklung haben und
dass bestimmte Aspekte neuronaler Migration über die örtliche Verfügbarkeit dieser
beiden Rezeptoren gesteuert werden.
In unseren Untersuchungen konnten wir zeigen, dass die Migrationstörungen
von Körnerzellen in vldlr -/- Mäusen vor
allem den Bereich
nahe der
Körnerzellschicht betreffen. Falsch positionierte Körnerzellen finden sich nur selten in
der polymorphen Schicht der Fascia dentata. Es scheint also, dass die Abwesenheit
von VLDLR vor allem mit einer unscharfen Grenze der Körnerzellschicht einhergeht
und nicht mit einer generellen Störung der Körnerzellpositionierung in der Fascia
dentata.
Beim Fehlen von ApoER2 hingegen finden sich falsch lokalisierte Körnerzellen
in einem größeren Gebiet. Sie lassen sich in der Molekularschicht und in großer Zahl
im Hilus nachweisen. Es kommt also in apoER2 -/- Tieren zu einer ausgeprägten
Störung der Körnerzellmigration und Positionierung.
Man darf allerdings nicht vernachlässigen, dass nicht nur ApoER2 und VLDLR
Rezeptoren für Reelin sind, sondern zum Beispiel auch α3β1 Integrin (Dulabon et al.,
2000). Dulabon und Kollegen konnten zeigen, dass Reelin durch Bindung an α3β1
50
Integrin zumindest in vitro neuronale Migration hemmt und Nervenzellen dazu
befähigt, sich von radialen Gliafasern zu lösen. Es könnten durchaus noch weitere
Moleküle als Rezeptoren oder Korezeptoren für Reelin hinzukommen, so dass
unsere Erklärungsversuche bezüglich der Unterschiede zwischen ApoER2- und
VLDLR-defizienten Mäusen sowie reeler Mäusen nur vorläufiger Natur sein können.
Dennoch ist es sinnvoll diese Beobachtungen mit den Migrationprozessen in
normalen und reeler Mäusen zu vergleichen (Stanfield and Cowan, 1979a). In
normalen
Mäusen
werden
Körnerzellen
entlang
der
tiefen
Anteile
des
suprapyramidalen Blattes und in einem Proliferationszentrum am Rand des
zukünftigen infrapyramidalen Blattes gebildet. Diese Zellen wandern daraufhin radiär
in oberflächlichere Bereiche der Körnerzellschicht, beziehungsweise in das
infrapyramidale
Blatt.
oberflächlichen
Anteile
In
rl
des
-/-
Mäusen
werden
suprapyramidalen
Körnerzellen
Blattes
entlang
gebildet
und
der
ein
Proliferationszentrum ist nicht erkennbar. Die Wanderung der Körnerzellen verläuft
umgekehrt und Körnerzellen wandern radiär in den Hilus. Es wäre möglich, dass
VLDLR und ApoER2 diese Prozesse unterschiedlich regulieren und sich so die
Unterschiede zwischen apoER2 -/- und vldlr -/- Mäusen erklären ließen. Zum Beispiel
könnte ApoER2 die radiale Wanderung zur Oberfläche der Körnerzellschicht steuern,
während VLDLR eine Rolle zusammen mit α3β1 Integrin beim Loslösen der
Nervenzellen von radialen Gliafasern spielen könnte. Weitere Experimente an vldlr -/und apoER2 -/- Mäusen sind in jedem Falle nötig, um die Rolle von ApoER2 und
VLDLR bei der Steuerung neuronaler Migration während der Entwicklung
aufzuklären.
51
V Zusammenfassung
Die Aufklärung von Entwicklungsprozessen, die zu spezifischen Verbindungen
zwischen
Nervenzellen
führen,
ist
ein
fundamentales
Ziel
der
modernen
Entwicklungsneurobiologie. Für diese Untersuchungen ist die Fascia dentata der
Hippokampusformation aufgrund ihrer überschaubaren Struktur und Konnektivität
besonders geeignet. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher untersucht,
welche Signale zur Entstehung spezifischer Verbindungen in der Fascia dentata
beitragen.
Die Fascia dentata ist gekennzeichnet durch die geschichtete Termination von
zwei afferenten glutamatergen Fasersystemen: Fasern aus dem entorhinalen Kortex
und kommissural/assoziativen Fasern aus dem kontralateralen Hippokampus. Die
entorhinalen Fasern enden in den äußeren zwei Dritteln der Molekularschicht, die
kommissural/assoziativen Fasern enden im inneren Drittel. Es wird vermutet, dass
diese Faserschichtung von der Anwesenheit eines spezifischen postsynaptischen
Partners zur Zeit des Fasereinwachsens während der Gehirnentwicklung abhängt.
Eine
Hypothese
vermutet,
dass
molekulare
Signale
auf
Körnerzellen
die
Fasersysteme in ihre jeweilige Schicht lenken. Um die Rolle von Körnerzellen beim
schichtenspezifischen Einwachsen der Afferenzen zu untersuchen, wurden daher die
Zyto- und Faserarchitektur von drei verschieden Mausmutanten (very-low-density
Lipoproteinrezeptor defizienten, Apolipoprotein E Rezeptor 2 defizienten und reeler
Mäusen) mit unterschiedlich stark ausgeprägten Körnerzellverteilungsstörungen
untersucht. Die afferenten Fasersysteme wurden mit dem anterograden Tracer
Phaseolus vulgaris-Leukoagglutinin dargestellt. In Kontrolltieren bilden Körnerzellen
eine kompakte Schicht. Diese Zellschichtung ist in vldlr -/- Mäusen leicht verändert,
in apoER2 -/- Mäusen stark gestört und in rl -/- Mäusen aufgehoben. Die
Veränderungen der Körnerzellanordnung spiegeln sich im Terminationsmuster
kommissuraler Fasern wider. Während diese Fasern im Kontrolltier geschichtet
enden, finden sie sich in den Mutanten über die Fascia dentata verteilt. Im
Gegensatz hierzu enden entorhinale Fasern in allen Mutanten innerhalb der äußeren
Molekularschicht. Zusammen mit früheren Befunden der Arbeitsgruppe legen diese
Ergebnisse nahe, dass die Schichtung kommissural/assoziativer Fasern von
molekularen Signalen auf Körnerzellen gesteuert wird, während die Schichtung
entorhinaler Fasern unabhängig von der Anordnung der Körnerzellen reguliert wird.
52
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Danksagung
Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. med. Thomas Deller,
für die stets herzliche und freundliche Unterstützung sowie die Überlassung des
Themas. Ohne sein Engagement und die gern und oft gewährte Hilfe wäre diese
Arbeit nicht möglich gewesen. Ebenso möchte ich Herrn Prof. Dr. med. Michael
Frotscher für seinen Rat und seine oft strapazierte Geduld danken. Bei Herrn Prof.
Dr. med. Stefan Pollak möchte ich mich für die Korrektur und Begutachtung meiner
Arbeit bedanken. Für viele freundliche und geduldige Ratschläge sowie das
Nahebringen neuer Techniken danke ich Herrn Dipl. Biol. Domenico Del Turco und
Herrn Tobias Merten. Für viele Ratschläge, Organisationstalent und Hilfe bei der
Zucht der Mausmutanten möchte ich den Herren Dr. med. Alexander Drakew und
Dipl. Chem. Albrecht Tielsch danken. Ganz besonders bedanke ich mich bei Herrn
Andreas Haaf und Frau Anikó Schneider für die exzellente und ausdauernde
technische Beratung und Unterstützung.
63
Lebenslauf
•
Geboren am 15.10.1975 in Ulm; Eltern: MUDr Eva Gebhardt und Dr. med.
Klaus Gebhardt
•
1981-1995 Schullaufbahn in Göppingen
•
1995 Abitur
•
1995-1996 Zivildienst im St. Josephskrankenhaus in Freiburg
•
1996 Beginn des Medizinstudiums in Freiburg
•
1998 Ärztliche Vorprüfung
•
1998 Beginn der Doktorarbeit im Anatomischen Institut I (Direktor: Prof. Dr.
med. M. Frotscher), in der Arbeitsgruppe von Herrn PD Dr. med. T. Deller
•
1999 1.Staatsexamen
•
2000 Aufnahme in die Studienstiftung des deutschen Volkes
•
2001 6-monatige Forschungstätigkeit in Frankfurt/Main. Dort Abschluss der
experimentellen Arbeiten.
•
2002 2.Staatsexamen
Freiburg, den 18.5.2003
64
Schriftenverzeichnis
•
25.3.2002: Vortrag im Rahmen der 97. Versammlung der Anatomischen
Gesellschaft in Halle / Saale:
C. Gebhardt, D. Del Turco, A. Drakew, A. Tielsch, J. Herz, M. Frotscher, and
T. Deller, Frankfurt/M, Freiburg, and Dallas, Texas, USA
“Malpositioning of granule cells alters the laminar organization of afferents to
the mouse fascia dentata: Morphological evidence from reeler, apoE receptor
2, and VLDL receptor knockout mice”.
•
Gebhardt C, Del Turco D, Drakew A, Tielsch A, Herz J, Frotscher M, and
Deller T (2002) Abnormal positioning of granule cells alters afferent fiber
distribution in the mouse fascia dentata: morphologic evidence from reeler,
apolipoprotein E receptor 2-, and very low density lipoprotein receptor
knockout mice. J Comp Neurol, 445: 278-292
•
Drakew A, Deller T, Heimrich B, Gebhardt C, Del Turco D, Tielsch A, Forster
E, Herz J, and Frotscher M (2002) Dentate granule cells in reeler mutants and
VLDLR and ApoER2 knockout mice. Exp Neurol, 176: 12-24
•
Deller T, Haas CA, Deissenrieder K, Del Turco D, Coulin C, Gebhardt C,
Drakew A, Schwarz K, Mundel P, and Frotscher M (2002) Laminar distribution
of synaptopodin in normal and reeler mouse brain depends on the position of
spine-bearing neurons. J Comp Neurol, 453: 33-44
•
D. Del Turco, C. Gebhardt, A. G. Woods, J. P. Kapfhammer, T. Naumann,
M. Frotscher, P. Caroni, and T. Deller (2001) Overexpression of the growth
associated protein CAP-23 results in translaminar commissural sprouting in
the hippocampus after entorhinal cortex lesion in adult mice. Soc. Neurosci.
Abstr. 27:698.12
•
D. Del Turco, C. Gebhardt, A. G. Woods, J. P. Kapfhammer, M. Frotscher,
P. Caroni, and T. Deller (2001) Mice overexpressing the growth associated
protein CAP23 show translaminar commissural sprouting in the hippocampus
after entorhinal cortex lesion. Acta Neuropathol. 102:523
•
T. Deller, C. Gebhardt, C. Coulin, P. Mundel und M. Frotscher (2000) Das
aktin-assoziierte Protein Synaptopodin im Gehirn der normalen und der
Reeler-Maus: Lokalisation im Dornhals und Assoziation mit dem Dornapparat
von Prinzipalzellen. Ann. Anat. 183, S. 226