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Medizinische Fakultät der Universität Duisburg-Essen Aus dem Institut für Physiologische Chemie Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus des Onkoproteins Bcl-2: Stabilisierung der Calciumhomöostase als Folge des Effektes von Bcl-2 auf zelluläres Glutathion Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin durch die Medizinische Fakultät der Universität Duisburg-Essen Vorgelegt von Matthäus Michael Rimpler aus Tychy/Polen 2003 Dekan: Univ.-Prof. Dr. H. Grosse-Wilde 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. H. de Groot 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. T. Möröy 3. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. W.A. Schulz, Düsseldorf Tag der mündlichen Prüfung: 22. Oktober 2003 2 Ergebnisse dieser Arbeit wurden veröffentlicht in: Rimpler, M.M., Rauen, U., Schmidt, T., Möröy, T. and H. de Groot. (1999). „Protection against hydrogen peroxide cytotoxicity in Rat-1 fibroblasts provided by the oncoprotein Bcl-2: maintenance of calcium homeostasis is secondary to the effect of Bcl-2 on cellular glutathione“ Biochemical Journal; 340: 291-297 Ergebnisse dieser Arbeit wurden auf folgenden Tagungen zur Fachdiskussion vorgestellt: 4. Workshop „Mechanismen der Zell- und Gewebeschädigung“, Giessen/Marburg 27.-29. November 1997 22. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Zellbiologie, Saarbrücken 15.-19. März 1998: Rimpler, M.M., Rauen, U.,Schmidt, T., Möröy, T. and H. de Groot. (1998). „Bcl-2 exerts its protective effect against hydrogen peroxide by maintaining glutathione levels“ European Journal of Cell Biology; 75 (suppl. 48): 41 Diese Arbeit wurde gefördert durch ein Stipendium der medizinischen Fakultät der Universität Essen (IFORES Programm) und den Fonds der Chemischen Industrie. 3 Inhaltsverzeichnis Seite 1. Einleitung 8 1.1 Das Onkoprotein Bcl-2 8 1.2 Reaktive Sauerstoffspezies und Apoptose 10 1.3 Der Schutzmechanismus von Bcl-2 11 2. Zielsetzung der Arbeit 12 3. Material und Methoden 13 3.1 Material 13 3.1.1 Chemikalien 13 3.1.2 Materialien zur Sterilisation 14 3.2 Zellen und Zellkultur 14 3.2.1 Herkunft und Eigenschaften der Zelllinien 14 3.2.2 Durchführung der Zellkultur 15 3.2.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen 15 3.2.4 Vorgehen bei Experimenten 16 3.2.5 Lösungen und Reagenzien für die Zellkultur 16 3.3 RNA-Techniken 18 3.3.1 Aufreinigung von RNA 18 3.3.2 Auftrennung von RNA 18 3.3.2.1 Lösungen und Reagenzien für die Auftrennung von RNA 19 3.3.3 Transfer von RNA auf Nylonmembranen: „Northern-Analyse“ 19 3.3.3.1 Kapillartransfer von RNA 19 3.3.3.2 Hybridisierung von RNA auf Nylonmembranen 20 3.4 Protein-Techniken 21 3.4.1 Herstellung von Gesamtzellproteinextrakten 21 3.4.2 Konzentrationsbestimmung von Proteinen 22 4 3.4.3 SDS-PAGE: Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen 22 3.4.4 „Western“-Analyse 23 3.4.4.1 Proteintransfer 23 3.4.4.2 Immunologischer Nachweis 24 3.4.4.3 Verwendete Antikörper 25 3.5 Vitalitätsbestimmungen 25 3.5.1 LDH-Freisetzung (nach Katrin, 1999) 25 3.5.1.1 Prinzip der Bestimmung 25 3.5.1.2 Lösungen und Reagenzien 26 3.5.2 Aufnahme von Trypanblau 27 3.6 Bestimmung des zellulären ATP-Gehaltes mittels Kapillarelektrophorese 27 3.6.1 Methode und Durchführung der Messungen 27 3.6.2 Probenaufbereitung 28 3.6.3 Lösungen und Reagenzien 29 3.7 Kinetik des H2O2-Abbaus 29 3.7.1 Prinzip der Messung 29 3.7.2 Versuchsdurchführung 29 3.7.3 Lösungen und Reagenzien 30 3.8 Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der intrazellulären Ca2+-Konzentration 30 3.8.1 Prinzip der digitalen Fluoreszenzmikroskopie 30 3.8.2 Versuchsdurchführung 32 3.9 Enzymatische Bestimmung von intrazellulärem Glutathion 32 3.9.1 Bestimmung von reduziertem Glutathion 32 3.9.1.1 Prinzip der Messung 32 3.9.1.2 Probenaufbereitung und Versuchsdurchführung 33 3.9.1.3 Lösungen und Reagenzien 33 3.9.2 Bestimmung von oxidiertem Glutathion 34 5 3.9.2.1 Prinzip der Messung 34 3.9.2.2 Probenaufbereitung und Versuchsdurchführung 34 3.9.2.3 Lösungen und Reagenzien 34 3.10 Bestimmung von intrazellulärem Glutathion auf Einzelzellebene 35 3.10.1 Prinzip der Bestimmung 35 3.10.2 Probenaufbereitung und Versuchsdurchführung 35 3.11 Statistik 35 4. Ergebnisse 36 4.1 Expression von Bcl-2 36 4.2 Effekte von Glucose, Quin-2 und der Überexpression von Bcl-2 auf den H2O2-induzierten Zelltod 4.3 36 Effekte von H2O2, Glucose und der Überexpression von Bcl-2 auf den Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration 40 4.4 Kinetik des zellulären H2O2-Abbaus von Rat-1-Fibroblasten 40 4.5 Effekte von H2O2 und Glucose auf den zellulären ATP-Gehalt von Rat-1-Fibroblasten 4.6 Effekte von Bcl-2, H2O2 und Glucose auf den Gehalt an GSH und GSSG von Rat-1-Fibroblasten 4.7 46 46 Bestimmung des intrazellulären Glutathion-Gehaltes auf Einzelzellebene 50 6 4.8 Effekte von N-Acetylcystein auf die Vitalität, den H2O2-induzierten Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration und den Glutathion-Gehalt von Rat-1-Fibroblasten 4.9 53 Effekte von BSO auf die Vitalität, den H2O2-induzierten Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration und den Glutathion-Gehalt von Rat-1-Fibroblasten 4.10 53 ffekte erhöhter H2O2-Konzentrationen auf die Vitalität und den H2O2-induzierten Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration von Rat-1/Bcl-2-Zellen 59 5. Diskussion 63 5.1 H2O2, Glutathion und Calciumhomöostase 63 5.2 Der Schutzeffekt von Bcl-2 64 5.3 Bcl-2 und zelluläres Glutathion 65 6. Abkürzungsverzeichnis 69 7. Zusammanfassung 71 8. Literaturverzeichnis 72 7 1. Einleitung 1.1 Das Onkoprotein Bcl-2 Die Bezeichnung des Proto-Onkogens bcl-2 bzw. des von diesem Gen kodierten Proteins Bcl-2 mit einer molekularen Masse von 26 kDa geht auf seine ursprüngliche Entdeckung in Non-Hodgkin B-Zell Lymphomen zurück (B-cell lymphoma). In diesen Tumoren konnte das Gen an den chromosomalen Bruchpunkten gefunden werden, die der Translokation t(14;18) zugrunde liegen. Dabei wird das bcl-2-Gen von seiner normalen Position auf 18q21 in die Nähe des Immunglobulin-Locus auf 14q32 transferiert und gerät so unter den Einfluss des starken IgH-Enhancers mit nachfolgender Überexpression des Bcl-2-Proteins (89). Die onkogene Eigenschaft von Bcl-2 beruht nicht auf der Steigerung der Zellproliferationsrate, sondern vielmehr auf der reduzierten Apoptoserate der betroffenen B-Zellen. Mit der Klonierung des ced-9 Gens von C. elegans konnte bcl-2 überdies als menschliches Homolog dieses anti-apoptotischen Proteins identifiziert werden. Die artifizielle Überexpression von Bcl-2 ist in verschiedenen Zellkulturen gelungen und erweist sich als potentes antiapoptotisches mitochondrialen Signal. Membran, Das Bcl-2-Protein dem ist primär endoplasmatischen an der Retikulum äußeren und der Zellkernmembran lokalisiert (47, 67, 87). Bcl-2 ist der Prototyp einer großen und weiterhin wachsenden Familie von Proteinen, der sogenannten Bcl-2-Familie. Die Mitglieder dieser Familie zeigen untereinander eine signifikante Homologie, obwohl einige dieser Proteine proapoptotische Wirkung zeigen, z.B. Bax und Bak (1, 71). Obwohl Bcl-2 und auch andere Bcl-2-Familienmitglieder als einzelne Proteine wirken können, wird ihre Aktivität durch Bildung von Homo- und Heterodimeren reguliert (15, 63, 72). Die Homologie zwischen den Familienmitgliedern ist innerhalb vier Domänen konserviert: BH 1, BH 2, BH 3 und BH 4 (78). Die BH 3 Domäne scheint essentiell für die Dimerisierung zu sein (Abbildung 1). Sequenzanalysen haben gezeigt, dass Bcl2, wie auch viele andere Mitglieder der Bcl-2 Familie, eine hydrophobe Aminosäurenkette am carboxyterminalen Ende aufweist, welche für die Lokalisation an den oben genannten intrazellulären Membranen verantwortlich ist (47, 66, 67, 87). 8 Abbildung 1: Struktur des humanen Bcl-2-Proteins Dargestellt ist die Position der 7 -helikalen Sequenzen und des TransmembranAnkers am C-terminalen Ende. Als BH1-BH4 werden die sogenanten „homology domains“ bezeichnet, welche als gemeinsame Elemente verschiedener Mitglieder der Bcl-2-Proteinfamilie gelten. Abbildung modifiziert nach Nature, Vol. 387: 773-776 (1997) 9 1.2 Reaktive Sauerstoffspezies und Apoptose In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass reaktive Sauerstoffspezies eine entscheidende Rolle in vielen Zellschädigungsmodellen einnehmen (Reviews: (14, 35, 39, 84)). Der Prozess der Apoptose kann durch die exogene Zugabe von reaktiven Sauerstoffspezies ausgelöst werden, wie z. B. Wasserstoffperoxid (H2O2), oder durch die Oxidation von endogenen Thiolen wie es für Menadion oder Diethylmaleat beschrieben wurde. Darüber hinaus ist in vielen Fällen der apoptotische Prozess selbst mit der Produktion von intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies assoziiert. Die intrazelluläre Bildung reaktiver Sauerstoffspezies kann durch unterschiedliche Stimuli initiiert werden, z. B. durch TumornekroseFaktor-α (TNF-α) oder Ceramid (37, 55, 64). Der molekulare Mechanismus der durch reaktive Sauerstoffspezies induzierten Zellschädigung ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Grundsätzlich können reaktive Sauerstoffspezies über die direkte Schädigung von Membranen, Membranproteinen und Nukleinsäuren zur Nekrose führen (26), in geringeren Dosen aber vor allem zur spezifischen Initiierung des Apoptose-Programms. Hierbei wurde z. B. die Induktion der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK, auch als „stress-activated proten kinase, SAPK, bezeichnet) diskutiert (91), ebenso wie die Aktivierung von p53 (2, 36, 53), beides Ereignisse, die über die konsekutive Aktivierung von Caspasen zum typischen morphologischen Bild der Apoptose führen. Reaktive Sauerstoffspezies führen in einigen Zellschädigungsmodellen zum Anstieg der cytosolischen und nukleären Ca2+-Konzentration (22). Nach Bindung von Ca2+ an Calmodulin bindet dieses wiederum an Calcineurin, eine Ca2+-abhängige Phosphatase, welche über die Aktivierung von Caspasen zur Apotose führen kann (22). Schliesslich können reaktive Sauerstoffspezies über die Thiol-Oxidation von mitochondrialen MembranProteinen zur Induktion der sogenannten „mitochondrial permeability transition (MPT)“ führen (16, 26, 46). Hierbei handelt es sich um eine Permeabilitätserhöhung der inneren mitochondrialen Membran und dem nachfolgenden Zusammenbruch des Membranpotentials Δφ. Der Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials gilt als wichtiges Ereignis während der Apoptose. Aufgrund der Tatsache, Zellschädigungsprozessen Antioxidantien diese führen Prozesse dass können, hemmen reaktive lag die könnten. Sauerstoffspezies Vermutung Dies nahe, wurde für zu dass viele natürlicherweise intrazellulär vorkommende Antioxidantien, wie z. B. intrazelluläres 10 Glutathion oder Thioredoxin, bestätigt (7, 14, 77, 84). Auch exogen zugeführte Antioxidantien wie z.B. N-Acetylcystein erwiesen sich als potente Inhibitoren von Zellschädigungsprozessen (58). Der ursprüngliche Vorschlag von Hockenbery et al. (37), dass auch das Bcl-2-Protein antioxidative Kapazität habe, basierte auf der Beobachtung, das die durch Menadion oder durch H 2O2 induzierte Apoptose in Zellen mit verstärkter Bcl-2-Expression gehemmt wurde. 1.3 Der Schutzmechanismus von Bcl-2 Es fällt auf, daß Bcl-2 die durch verschiedene Auslöser initiierte Zellschädigung inhibieren kann. Hierzu zählen die Zellschädigung durch Glucocorticoide, DLButhionin-(S, R)-sulfoximin (BSO), Ca2+-Ionophore, -Strahlung, Menadion, reaktive Sauerstoffspezies oder durch den Entzug von Interleukin-3 (62, 78). Der Mechanismus der biologischen Wirkung des Bcl-2-Proteins wird seit langem kontrovers diskutiert. In einigen der o. g. Schädigungsprozesse scheint die Störung der Ca 2+-Homöostase, hier insbesondere der cytosolische Anstieg der Ca2+-Konzentration eine entscheidende cytotoxizitätsvermittelnde Rolle zu spielen (59). Dementsprechend wurden die Effekte von Bcl-2 auf die Ca2+-Homöostase bzw. den Ca2+-vermittelten Zelltod in einer Vielzahl von Modellen untersucht (6, 11, 18, 19, 33, 56, 65, 79, 99). Diese Untersuchungen führten jedoch zu teilweise widersprüchlichen Ergebnissen und ergaben kein klares Bild hinsichtlich der Rolle von Bcl-2 bei Ca2+-vermittelten Zellschädigungsprozessen. Vor allem blieb unklar, ob Bcl-2 die intrazelluläre Ca2+Kompartimentierung direkt durch Beeinflussung der transmembranären Ca 2+-Ströme reguliert oder ob hier vorgeschaltete Ereignisse eine entscheidende Rolle spielen. In mehreren Studien an unterschiedlichen Zelltypen konnte ein Effekt von Bcl-2 auf zelluläres Glutathion gezeigt werden. Die beschriebenen Effekte waren vielfältig, so wurde berichtet über eine Hochregulierung der cytosolischen Glutathionsynthese oder über die Erhöhung der Apoptoseresistenz durch einen „Shift“ des Oxidations/Reduktionspotentials hin zu einem mehr reduzierten Zustand (21, 61, 64, 90, 93). In anderen Arbeiten wurde eine Umverteilung des zellulären Glutathions in den Zellkern mit verbessertem Schutz vor DNA-Fragmentation beschrieben (95). Leider wurde in diesen Studien über die Zusammenhänge von Bcl-2 und zellulärem Glutathion nicht der Einfluss auf die Ca2+-Homöostase untersucht, obwohl in mehreren Zellschädigungsmodellen durchaus Verbindungen zwischen dem 11 zellulären Calcium- und dem Glutathionmetabolismus etabliert werden konnten. Letzteres trifft vor allem auf das Modell der H2O2-vermittelten Zellschädigung zu, die über mehrere Jahre intensiv untersucht wurde (25, 34, 68). Im Rahmen dieses Modells wurde auch eine protektive Wirkung von Bcl-2 im Sinne einer Hemmung des cytosolischen Ca2+-Anstieges beschrieben (18, 37, 100). Darüberhinaus wird in mehreren Modellen der Schutzeffekt von Bcl-2 auf die Hemmung der MPT (s.o.) zurückgeführt, ebenso wie auf die Heterodimerisierung und Inaktivierung von proapoptotischem Bax (78). Die genauen zugrundeliegenden Mechanismen blieben jedoch unklar. 2. Zielsetzung der Arbeit Ziel dieser Arbeit ist es, ein Modell zu entwickeln, welches die unterschiedlichen Effekte von Bcl-2 auf die intrazelluläre Ca2+- und Glutathionhomöostase vereinen kann. Insbesondere soll in dieser Arbeit geprüft werden, ob in Rat-1-Fibroblasten nach Schädigung mit H2O2 die Erhöhung der cytosolischen Ca2+-Konzentration sekundär nach Oxidation des zellulären Glutathion-Pools auftritt und ob die Aufrechterhaltung der Ca2+-Homöostase durch Bcl-2 nur indirekt über den Effekt auf zelluläres Glutathion vermittelt wird. 12 3. Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Chemikalien Folgende Übersicht gibt Auskunft über die Quellen der jeweiligen Chemikalien: H2O2 Sigma, Deisenhofen Probenicid Sigma, Deisenhofen Buthionin-Sulfoximin (BSO) Sigma, Deisenhofen Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) Sigma, Deisenhofen N-Acetylcystein Sigma, Deisenhofen Methylglyoxal Sigma, Deisenhofen Glyoxalase I Sigma, Deisenhofen Monochlorobiman Molecular Probes, Eugene, OR, USA Pluronic F-127 Molecular Probes, Eugene, OR, USA Quin-2-AM Molecular Probes, Eugene, OR, USA Fura-2-AM Molecular Probes, Eugene, OR, USA Peroxidase Boehringer, Mannheim Glutathion-Reduktase Boehringer, Mannheim Dulbeccos´s modified eagle medium Gibco, Eggenstein Fetal calf serum Gibco, Eggenstein Die im Text näher bezeichneten Antikörper wurden von folgenden Firmen bezogen: Fa. Santa Cruz, Santa Cruz/Heidelberg Fa. Dianova, Hamburg Fa. Biorad, München Alle anderen Chemikalien stammten von Merck, Darmstadt. 13 3.1.2 Materialien zur Sterilisation Die Sterilisation der für die Zellkultur verwendeten Materialien erfolgte in einem Autoklaven der Firma Varioklav (München). Zur Sterilfiltration wurden RotrandEinmalfilter (Schleicher & Schuell, Dassel) verwendet. Größere Volumina wurden unter Verwendung eines Sartoban-Filters (Sartorius, Göttingen) und eines Druckbehälters (Sartorius, Göttingen) sterilfiltriert. Zur sterilen Arbeit mit den Zellkulturen stand eine Sterilbank der Firma Babcock-BSH (Bad Hersfeld) zur Verfügung. 3.2 Zellen und Zellkultur 3.2.1 Herkunft und Eigenschaften der Zelllinien Die in dieser Arbeit verwendeten Zelllinien stammen aus dem Labor von Dr. G. I. Evan und Dr. T. Littlewood (Biochemistry of the Cell Nucleus Laboratory, Imperial Cancer Research Fund, London, U. K.). Zur Untersuchung der Funktion von Bcl-2 wurden zwei individuelle Zellklone von Rat1-Fibroblasten verwendet, welche stabil mit einem retroviralen Vektor transfiziert wurden, der eine konstitutive Expression von humanem Bcl-2 vermittelt (Rat-1/Bcl2#1 und Rat-1/Bcl-2#2). Gemeinsam mit dem Gen für das Bcl-2-Protein befand sich auf dem retroviralen Vektor ein Puromycin-Resistenzgen, welches die sichere Selektion von effektiv transfizierten Rat-1-Fibroblasten ermöglicht (24). Als KontrollZelllinie wurden nicht transfizierte Rat-1-Fibroblasten verwandt, im folgenden als „Rat-1/Wildtyp“ bezeichnet. Um auszuschliessen, dass allein die Transfektion mit einem retroviralen Vektor das biologische Verhalten von Rat-1-Fibroblasten signifikant verändert, wurde als Vektorkontrolle eine Zelllinie von Rat-1-Fibroblasten eingesetzt, die konstitutiv ein chimäres Protein exprimierten, welches aus einem kompletten c-Myc Polypeptid, fusioniert an einen Teil eines mutierten, humanen Östrogenrezeptors, besteht (Rat-1/cMycER). Dieser modifizierte Östrogenrezeptor kann kein Östrogen binden, zeigt jedoch eine normale Affinität für den synthetischen Liganden 4-Hydroxy-Tamoxifen (4-OHT). Nur nach Bindung von 4-OHT kommt es zu einer Aktivierung von c-Myc (38, 51). Auch der hier verwendete retrovirale Vektor kodierte zusätzlich für ein Puromycin-Resistenzgen. 4-Hydroxy-Tamoxifen war bei den hier durchgeführten Experimenten grundsätzlich nicht anwesend, c-Myc war daher inaktiv. 14 3.2.2 Durchführung der Zellkultur Die Zellkultur erfolgte in Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM, low glucose) unter Zusatz von 10% (v/v) fetalem, hitzeinaktiviertem Kälberserum (FCS), und Penicillin/Streptomycin (100 Units/ml bzw. 100 µg/ml). Nach jeweils 5 Passagen wurden die transfizierten Zellen für jeweils zwei Tage mit 5 µg/ml Puromycin kultiviert, um eine positive Selektion der effizient transfizierten Zellen zu gewährleisten. Subkulturen wurden erreicht durch Trypsinierung für 5 min unter leichtem manuellen Schwenken, mit Beendigung der Reaktion durch Resuspension in DMEM/10% FCS und anschliessendem Überführen einer geeigneten Zellzahl in Zellkulturflaschen. Die Subkultivierung erfolgte in 75 cm 2 Zellkulturflaschen mit 20 ml Zellkulturmedium. Für Vitalitätsbestimmungen wurden die Zellen in 6-well Zellkulturplatten angeimpft und über 24 h in 2,5 ml supplementiertem DMEM kultiviert. Für die Bestimmung des zellulären ATP-Gehaltes wurden 25 cm2 Zellkulturflaschen verwendet und zur fluoreszenzmikroskopischen Calciummessung wurden die Zellen auf Glasplättchen mit einem Durchmesser von 28 mm ausplatiert, welche in 6-well-Zellkulturplatten eingelegt und unter gleichen Bedingungen über 24 h kultiviert wurden. Die Zellen, die für ein Experiment eingesetzt wurden, wurden jeweils am gleichen Tag subkultiviert. Die Zelldichte betrug 1,0 – 1,2 x 105/cm2 am Tag des Experimentes. 3.2.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen Für die langfristige Lagerung von Zelllinien wurden die Zellen durch 5-minütige Zentrifugation bei 900 rpm pelletiert und in 1 ml Einfriermedium resuspendiert. Die Zellsuspension (5 x 106 Zellen/ml) wurde in Einfrierröhrchen transferiert und in einem Styroporkästchen bei –80°C gelagert. Nach 48 h konnten die Röhrchen in flüssigen Stickstoff überführt werden. Das Auftauen von Zellen erfolgte möglichst schnell in einem Wasserbad bei 37°C. Anschliessend wurden die Zellen in ein 15-ml-Polypropylen-Röhrchen überführt und es wurde tropfenweise Zellkulturmedium zugeführt, um eine Schädigung der Zellen aufgrund des unterschiedlichen osmotischen Wertes von DMSO bzw. Zellkulturmedium zu vermeiden. Nach Zentrifugation der Zellen und Aufnahme in frisches Medium konnten diese in das jeweilige Gefäß ausgesät werden. 15 3.2.4 Vorgehen bei Experimenten Zu Beginn jedes Experimentes wurden die Zellen dreimal mit Hanks´ balanced salt solution (HBSS) gewaschen und dann mit Krebs-Henseleit-Puffer bedeckt (KH). Die Inkubation der Zellen erfolgte bei 37°C mit 5% CO2/95% Raumluft. Die Zugabe von H2O2 erfolgte zu Beginn des Experiments aus einer frisch angesetzten 100 mM Stammlösung mit 100 µM DTPA. Falls vorgesehen, wurde BSO (0,5 mM) 10 h und Quin-2-AM (10 µM) oder N-Acetylcystein (40 mM) 1 h vor Beginn des Experimentes zugegeben. 3.2.5 Lösungen und Reagenzien für die Zellkultur Hanks´ balanced salt solution (HBSS): CaCl2 1,3 mM KCl 5,3 mM KH2PO4 0,4 mM MgCl2 x 6 H2O 0,4 mM MgSO4 x 7 H2O 0,4 mM 136,8 mM NaCl NaHCO3 15 mM Na2HPO4 x 7 H2O 0,3 mM HEPES 25 mM NaCl 115 mM NaHCO3 25 mM KCl 5,9 mM MgCl2 1,2 mM NaH2PO4 1,2 mM Na2SO4 1,2 mM CaCl2 2,5 mM HEPES 20 mM DTPA 100 µM pH=7,4 Krebs-Henseleit-Puffer (KH): pH=7,4 16 Trypsinlösung: Trypsin 0,5% EDTA 0,2% 5% Trypsin-Stammlösung wurde mit Citrat-Saline im Verhältnis 1:10 verdünnt und konnte, gelagert bei +4°C, 2-3 Wochen verwendet werden. Citrat-Saline (10x): Na-Citrat 150 mM KCl 1,34 M pH=7,3 Einfriermedium: Supplementiertes Zellkulturmedium 50% (v/v) FCS 40% (v/v) DMSO 10% (v/v) Zellkulturmedium: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Pulver mit 1000 mg/L D-glucose mit L-Glutamin mit 110 mg/L Natrium-Pyruvat Katalognummer: 31600, Gibco 17 3.3 RNA- Techniken Beim Arbeiten mit RNA sind zum Schutz vor RNase-Kontaminationen bestimmte Vorsichtsmaßnahmen notwendig. Dazu gehören das ausschließliche Arbeiten mit Latex-Einmalhandschuhen, das Behandeln von Lösungen mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) und anschließendem Autoklavieren sowie das Ausbacken von Geräten für 3 h bei 180°C. 3.3.1 Aufreinigung von RNA Die Isolation von Gesamt-RNA aus den konfluent in Zellkulturflaschen gewachsenen Zelllinien erfolgte unter Anwendung des „RNeasy-Kits“ (Fa. Qiagen, Hilden) nach dem Protokoll des Herstellers. Nach Aufnahme der Zellen in den Lyse-Puffer wurden diese in 14-ml-Schnappdeckel-Falcons mit einem Ultra-Turrax (Fa. Janke & Kunkel, Staufen) homogenisiert. Die Elution erfolgte nach leichter Modifikation des Protokolls mit 3 x 30 µl DEPC-behandeltem H2O. Die so gewonnene RNA wurde photometrisch vermessen und bei –80°C zur Lagerung eingefroren oder direkt für die Auftrennung eingesetzt. 3.3.2 Auftrennung von RNA Für die elektrophoretische Auftrennung von RNA fanden denaturierende Formaldehydgele Verwendung (49). Dazu wurden 1,5 g Agarose, 120 ml DEPCbehandeltes H2O und 1 µl Ethidiumbromidlösung in einem Erlenmeyerkolben aufgekocht und auf 60C heruntergekühlt. Danach wurden 26 ml 37% Formaldehydlösung und 3 ml 50x MOPS hinzugefügt und das Gel in einen waagerechten Schlitten gegossen. Von der aufzutragenden RNA wurden 10-12 µg bis zu einem Volumen von unter 6 µl eingedampft, mit 20-30 µl Denaturierungspuffer versetzt und für 15 min bei 56C inkubiert. Nach Zugabe einer entsprechenden Menge 6x Probenpuffer wurden die Proben auf das Gel aufgetragen und bei 100 V für etwa 6 h in 1x MOPS-Laufpuffer elektrophoretisch aufgetrennt. Über das gebundene Ethidiumbromid konnte die RNA unter UV-Licht direkt sichtbar gemacht werden. 18 3.3.2.1 Lösungen und Reagenzien für die Auftrennung von RNA 50x MOPS-Lösung: MOPS 104,6 g Na-Acetat 10,3 g EDTA, 0,5 M, pH 8,0 5 ml ad 500 ml DEPC-behandeltes H2O Einstellen des pH mit 10 N NaOH auf 7,0 Denaturierungspuffer: Formaldehydlösung, 37% 356 µl Formamid 124 µl 50x MOPS 22 µl Ethidiumbromidlösung 1 µl 10x SSC: NaCl 1,5 M Na-Citrat 0,15 M pH= 7,5 3.3.3 Transfer von RNA auf Nylonmembranen: „Northern-Analyse“ 3.3.3.1 Kapillartransfer von RNA Der Kapillartransfer erfolgte nach der Methode von Thomas et. al (88). Nach der elektrophoretischen Auftrennung von RNA in einem denaturierenden Formaldehydgel, wurde dieses für 30 min in 10x SSC-Lösung äquilibriert. Der Transfer auf die NC-Membran Hybond N+ (Fa. Amersham, London) erfolgte durch einen Schwerkraft-SSC-Blot (45), der wie folgt aufgebaut wurde: Auf eine Glasplatte wurde zunächst ein 2-4 cm hoher Stapel aus Whatman 3M-Papier (Fa. Schleicher & Schuell, Dassel) in gleicher Größe zum Gel gelegt, von denen die letzten beiden Lagen mit 10x SSC angefeuchtet wurden. Darauf kam die angefeuchtete, zurechtgeschnittene Membran zu liegen, und auf der wiederum das vorbehandelte 19 Gel. Auf das Gel kamen 2 weitere Lagen angefeuchtetes Whatman 3M-Papier und hierauf eine angefeuchtete Brücke ebenfalls aus 2 Whatman 3M-Papieren, deren Enden in eine Plastikwanne mit 10x SSC eintauchten (Transferpuffer). Den Abschluß bildete wieder eine Glasplatte, die zudem mit einem Gewicht von ca. 500 g beschwert wurde. Der Transfer erfolgte durch Schwerkraft und Flüssigkeitsstrom für ca. 16 h, nach denen der Blot abgebaut und die Membran zur Entfernung von Agarosebestandteilen kurz in 2x SSC gewaschen wurde. Zur kovalenten Bindung der RNA auf der Membran wurde diese in einem UV-Stratalinker 2400 (Fa. Stratagene; Amsterdam) für 30 sec mit 120 mJ/cm2 kreuzvernetzt. 3.3.3.2 Zur Hybridisierung von RNA auf Nylonmembranen Hybridisierung wurden die Membranen in Polyethylenfolie mit Hybridisierungslösung luftblasenfrei eingeschweißt und zunächst für mindestens 2 h bei 65°C inkubiert (sog. Prähybridisierung). Nach dieser Inkubationszeit wurde die Lösung gegen Hybridisierungslösung ausgetauscht, die eine radioaktiv markierte Sonde (siehe unten) mit ca. 1x106 counts/ml enthielt. Die Hybridisierung erfolgte für 12 h bei 65°C. Anschließend wurde die Membran mehrmals mit 2x SSC / 0,1 % SDS gewaschen und autoradiographisch ausgewertet. Verwendete DNA-Sonde: Sonde: Beschreibung: Herkunft/Referenz: bcl-2 0,7 kb HindIII/XbaI murines cDNA-Fragment S. Korsmeyer (70) Hybridisierungslösung: SDS 7 % (w/v) BSA 1% (w/v) Formamid 15 % (v/v) Na2HPO4/NaH2PO4 0,2 M, pH= 7,2 EDTA 2 mM Heringssperma-DNA (10 mg/ml), denaturiert 1 ml ad 100 ml DEPC-H2O 20 3.4 Protein-Techniken 3.4.1 Herstellung von Gesamtzellproteinextrakten Das Vorgehen erfolgte in Anlehnung an die Methodensammlung von Sambrook et al. (81). Zur Isolierung von gesamtzellulären Proteinen wurden Zellen einer konfluent bewachsenen Zellkulturschale oder Suspensionszellen dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen. Die adhärent wachsenden Zellen wurden anschließend mit Hilfe eines Gummischabers in 1 ml PBS von der Schale abgelöst. Die Zellen wurden dann abzentrifugiert (Minifuge, 2 min, 2000 Upm, 4°C) und in 100 µl WCE-Puffer aufgenommen. Unlösliche Bestandteile wurden durch Zentrifugation abgetrennt (Eppendorfzentrifuge, 10 min, 14000 Upm, 4°C). Die im Überstand enthaltenen Proteine wurden nach einer Proteinbestimmung (vgl. 3.4.2) in Aliquots bei -80°C gelagert. WCE-Puffer: HEPES 50 mM, pH=7,8 NaCl 450 mM EDTA 0,2 mM Na-Ortho-Vanadat NaF Glyzerin 1 mM 20 mM 25% (v/v) Der Puffer wurde bei -20 °C gelagert, vor Gebrauch wurden folgende Substanzen frisch zugegeben: Aprotinin 50 µg Leupeptin 50 µg DTT 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid 1 mM NP 40 1% (v/v) 21 3.4.2 Konzentrationsbestimmung von Proteinen Die Konzentrationsbestimmung von Proteinen wurde nach der Methode von Bradford durchgeführt (13). Hierzu wurde ein kommerziell erhältliches Farbreagenz (BradfordReagenz, Fa. Biorad/München) benutzt. 2 µl der jeweiligen Probe (vgl. 2.4.1) wurden mit 800 µl Wasser und 200 µl Farbreagenz in einer Polystyrol-Einmalküvette vermischt und für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Aus einem Leerwert und einer Verdünnungsreihe aus BSA-Standards (2, 4, 6, 8, 10 µg/ml) wurde eine Eichkurve erstellt. Die Auswertung erfolgte mit einem Photometer bei = 595 nm. 3.4.3 SDS-PAGE Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen Die elektrophoretische Auftrennung von Proteinen fand in diskontinuierlichen, denaturierenden SDS-PAGE, unter Verwendung der Mini-Proteingelapparaturen der Fa. Keutz (Reiskirchen), statt (81). Hierzu wurde zuerst zu 4/5 der Gelapparaturhöhe das Trenngel gegossen und, um eine glatte Oberfläche zu erhalten, mit Isopropanol überschichtet. Nach vollständiger Polymerisation wurde das Isopropanol entfernt, das Sammelgel gegossen und anschließend der Probenkamm eingesetzt. Die aufzutragenden Proteinproben wurden mit dem gleichen Volumen an 2x SDSProbenpuffer versetzt, für 5 min bei 95C denaturiert und kurz abzentrifugiert. Die Auftrennung erfolgte für 2-3 h bei 30 mA mit 1x SDS-Laufpuffer. Als Molekulargewichtsstandards dienten 2 µl RainbowTM-Marker (Fa. Amersham, London). Trenngel Trenngelpuffer Sammelgel 4,25 ml Sammelgelpuffer 2,25 ml 30% PAALösung 5,7 ml 1,2 ml H2O 6,6 ml 5,3 ml 10% APS 150 µl 200 µl TEMED 8,5 µl 15 µl Tabelle 1: Zusammensetzung der denaturierenden Proteingele 22 Trenngelpuffer: Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 SDS 0,4 % (w/v) Sammelgelpuffer: Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 SDS 0,4 % (w/v) 1x SDS-Laufpuffer : Tris-Base 5,2 mM Glycin 5,3 mM SDS 0,01 (w/v) % 2x SDS-Probenpuffer: Tris-HCl 100 mM, pH 6,8 Glycerin 30 % (v/v) SDS 3 % (w/v) -Mercaptoethanol 5 % (v/v) Bromphenolblau 0,1 % (w/v) 3.4.4 „Western“-Analyse 3.4.4.1 Proteintransfer Der Proteintransfer erfolgte entsprechend der Methodensammlung von Sambrook et al. (81). Für die Immobilisierung von Proteinen auf einer Membran wurde das sogenannte „semi-dry“ Verfahren in einer Transferapparatur (Fa. Keutz, Reiskirchen) angewandt. Dazu wurde auf der Anode ein Blot in nachstehender Reihenfolge aufgebaut: 3 Whatman 3M-Papiere mit Anodenpuffer 1 angefeuchtet, 4 Whatman 3M-Papiere mit Anodenpuffer 2 angefeuchtet, eine Nitrocellulosemembran (Fa. Schleicher & Schuell, Dassel) ebenfalls mit Anodenpuffer 2 angefeuchtet, das Proteingel und abschließend 5 Whatman 3M-Papiere mit Kathodenpuffer angefeuchtet. Der Transfer fand für 2 h bei 1,5 mA/cm 2 Membran statt. Zur Kontrolle 23 des Transfers wurde die Membran kurz mit Ponceau-Rot angefärbt und mit PBS wieder entfärbt. Anodenpuffer 1: Tris-HCl 25 mM Methanol 20% (v/v) pH = 10,4 Anodenpuffer 2 : Tris-HCl 300 mM Methanol 20% (v/v) pH = 10,4 Kathodenpuffer: Tris-HCl 25 mM 6-Aminohexansäure 40 mM Methanol 20% (v/v) pH = 9,4 3.4.4.2 Immunologischer Nachweis Vor Zugabe des primären Antikörpers wurde zur Absättigung freier unspezifischer Bindungsstellen die Membran zunächst für 30 min in PBS/0,1% Tween 20/5% Magermilchpulver (Blotto-Lösung) geschwenkt. Hiernach wurde der erste Antikörper (siehe unten) in entsprechender Verdünnung in der selben Lösung zugegeben und für 2 h unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS/0,1% Tween 20 wurde die Membran für 2 h mit einem zweiten Antikörper (siehe unten) bei Raumtemperatur inkubiert. Zuletzt wurde nach erneutem mehrmaligem Waschen mit PBS/0,1% Tween Meerrettichperoxidase-gekoppelten 20 die Membran Sekundärantikörper für 2 (siehe h mit einem unten) weiter inkubiert. Der Blot wurde nach wiederholtem Waschen mit PBS/0,1% Tween 20 in einer luminiszierenden Lösung (ECL-Kit) der Fa. Amersham (London) eingelegt und anschließend autoradiographisch ausgewertet. 24 3.4.4.3 Verwendete Antikörper 1. Antikörper: Bezeichnung: Beschreibung: Artikel-Nr./Herkunft: Bcl-2 (N-19) Goat polyclonal IgG # sc-492 Fa. Santa Cruz 2. Antikörper: Bezeichnung: Beschreibung: Artikel-Nr./Herkunft: Anti-Ziege IgG (H+L) Mouse anti-goat # 205-035-108 aus der Maus Fa. Dianova 3. Antikörper: Bezeichnung: Beschreibung: Artikel-Nr./Herkunft: Anti-Maus Peroxidase-gekoppelter # 170-6516 Sekundärantikörper gegen Fa. Biorad primäre monoklonale Maus-Antikörper des Typs IgG 3.5 Vitalitätsbestimmungen Vitalitätsbestimmungen von Rat-1-Fibroblasten wurden in dieser Arbeit mit Hilfe des LDH-Assays sowie mittels Aufnahme von Trypanblau durchgeführt. 3.5.1 LDH-Freisetzung: 3.5.1.1 Prinzip der Bestimmung Der LDH-Assay beruht auf der Tatsache, daß cytosolische Enzyme im Verlaufe der Zellschädigung aus dem Cytosol der Zellen in das umgebende Medium austreten. Dieses geschieht aufgrund des Verlustes der Zellmembranintegrität, welches zwar ein spätes, aber sehr sicheres Zeichen des Zelltodes darstellt (41). Im Verlaufe der Vitalitätsversuche wurden zu bestimmten Zeitpunkten Proben von 250 µL aus dem Versuchsmedium entnommen, welche der photometrischen Analyse zur Bestimmung der LDH-Aktivität zugeführt wurden. Am Versuchsende wurden alle 25 Zellen für 20 min bei 37°C mit dem Detergens Triton X-100 (Endkonzentration 1%) inkubiert, wodurch es zur Lyse aller noch lebenden Zellen kam. Auf diese Weise war es möglich, die Gesamt-LDH-Aktivität aller Zellen im Versuchsansatz zu bestimmen. Durch Bildung des Quotienten (LDH-Aktivität zum Zeitpunkt t/Gesamt-LDH-Aktivität) * 100 konnte die Zellschädigung in den jeweiligen Zeitpunkten prozentual angegeben werden. Die Bestimmung der LDH-Aktivität erfolgte photometrisch mit dem ACP 5040 (Eppendorf, Hamburg) nach der Methode von Bergmeyer (10). Das Prinzip der Messung beruhte auf der Reaktion: LDH Pyruvat + NADH + H+ Lactat + NAD+ Hierbei wurde die zeitliche Abnahme des NADH im Probenansatz über die spezifische Extinktion bei einer Wellenlänge von 334 nm bestimmt. Dabei wurde eine LDH-Probe aus dem Versuchsansatz mit dem Kalium-Phosphat-Reaktionspuffer versetzt, die Geschwindigkeit der Abnahme der Extinktion war proportional zur Aktivität des Enzyms. 3.5.1.2 Lösungen und Reagenzien: Kalium-Phosphat-Reaktionspuffer: K2HPO4 50 mM Na+-Pyruvat 0,6 mM NADH 0,19 mM pH = 7,4 26 3.5.2 Aufnahme von Trypanblau: Diese Methode beruht auf der Eigenschaft von Zellen, den Farbstoff Trypanblau aufzunehmen, sobald die Integrität der Zellmembran zerstört wird, d.h. sobald der Zelltod eintritt. Vitale Zellen mit intakter Plasmamembran sind hingegen in der Lage, die Penetration des Farbstoffes zu verhindern (41), wodurch eine Unterscheidung vitaler von avitalen Zellen möglich war. Die Zellen wurden mit Hilfe eines inversen Mikroskops (ID 03, Zeiss, Oberkochen) ausgezählt und der prozentuale Anteil der avitalen Zellen bestimmt. 3.6 Bestimmung des zellulären ATP-Gehaltes mittels Kapillarelektrophorese 3.6.1 Methode und Durchführung der Messungen Die Kapillarelektrophorese (CE) ist eine Methode zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von verschiedenen biochemischen Produkten in Lösungen, wie z.B. Aminosäuren, DNA und ATP, aber auch zur Bestimmung von Elektrolytkonzentrationen in Zelllysaten (40, 74, 82). Das Prinzip der Trennung und Detektion von biologischen Proben mit der CE beruht auf der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit von geladenen Molekülen in einem elektrischen Feld, wobei eine Pufferlösung als Trägersubstanz und Spannungsvermittler eingesetzt wird. Das Kernstück der in dieser Arbeit benutzten CE bildet eine Quarzkapillare der Länge 57 cm und einem Innendurchmesser von 75 µm. Die Kapillare tauchte an beiden Enden in zwei Gefäße mit der Pufferlösung ein, welche über Platinelektroden mit einer Hochspannungsquelle verbunden waren. Die Injektion der Proben erfolgte druckgesteuert unmittelbar vor Meßbeginn. Der hier verwendeten Pufferlösung wurde das Detergens Dodecyltrimethylammoniumbromid (DTAB) hinzugefügt. Durch die Anlagerung des Detergens entstand an der ursprünglich negativen Kapillarwand eine positive Ladung, wodurch der elektroosmotische Fluss und die resultierende Wanderungsgeschwindigkeit der ATPMoleküle zum Detektor gerichtet waren (29). Die angelegte Spannung zwischen Anode und Kathode betrug 12,5 kV, die Temperatur während der Messung wurde auf 23°C eingestellt. Die Detektion der aufgetrennten Moleküle erfolgte bei dem hier eingesetzten Beckmann P/ACE 5000 Kapillarelektrophorese-System (Beckmann, München) über einen UV-Detektor, welcher die Absorption bei einer Wellenlänge von 254 nm misst. 27 Die Fläche der Peaks im aufgezeichneten Elektrophoresegramm war der Konzentration der vorbeilaufenden ATP-Moleküle direkt proportional und konnte direkt über ein angeschlossenes, PC-gesteuertes Datenverarbeitungssystem bestimmt werden. Der absolute Wert der ATP-Konzentration wurde unter Verwendung eines ATP-Standards (Konzentration des Standards: 50 µM) bestimmt. 3.6.2 Probenaufbereitung: Für die Bestimmung des ATP-Gehaltes von Rat-1-Fibroblasten wurden Kulturflaschen mit einer Oberfläche von 25 cm 2 verwendet. Die Versuchsansätze enthielten 6,5 ml Krebs-Henseleit-Puffer mit den im Ergebnisteil angegebenen Endkonzentrationen an H2O2 bzw. Glucose. Die Versuche wurden nach einer Zeitdauer von 0 min, 30 min oder 60 min gestoppt durch die Zugabe von 9 M Perchlorsäure, bei einer Endkonzentration von 1 M im entstandenen Zelllysat. Sofort danach wurde die Zellkulturflasche in flüssigen Stickstoff getaucht. Nach dem Antauen des Zellrasens wurde dieser mit einem Gummispatel abgekratzt, in Eppendorf-Cups überführt und zentrifugiert. Zu dem Überstand wurden 25 µl einer Methylorange-Stammlösung hinzugefügt (0,5 mg/ml in Aqua dest.). Letztere diente als pH-Indikator bei der anschließenden Neutralisierung mit einer 5 M Kaliumcarbonatlösung. Das ausgefallene Kaliumperchlorat wurde abzentrifugiert, der Überstand 1:10 mit Aqua dest. verdünnt, um die Ionenstärke herabzusetzen. Anschließend wurden die Proben der Messung in der Kapillarelektrophorese zugeführt. Um den ATP-Gehalt pro 106 Zellen angeben zu können, wurde die Anzahl der Zellen in einem Versuchsansatz bestimmt. Dies geschah durch Trypsinierung des Zellrasens in einer Zellkulturflasche welche gemeinsam mit den Zellkulturflaschen für das jeweilige Experiment angeimpft wurde. Die trypsinierten Zellen wurden in ein definiertes Volumen Zellkulturmedium aufgenommen, die Zählung erfolgte mit der Neubauer-Zählkammer. 28 3.6.3 Lösungen und Reagenzien: Perchlorsäure 9M Methylorange-Stammlösung 0,5 mg/ml Aqua dest. Kaliumcarbonat 5M Elektrophoresepuffer: NaPO4- 50 mM DTAB 100 mM EDTA 1 mM 3.7 Kinetik des H2O2-Abbaus 3.7.1 Prinzip der Messung Die Bestimmung der extrazellulären Konzentration von H 2O2 erfolgte entsprechend dem Ansatz von Fossati et al. (27) durch die Peroxidase-katalysierte Konversion von 4-Aminophenazon zu der pinkfarbenen Substanz N-4-Antipyryl-3-Chloro-5-Sulfonat-Benzoquinon-Monoimin: 3,5-Dichloro-2-Hydroxybenzensulfonsäure + 4-Aminophenazon + 2 H2O2 Peroxidase N-4-Antipyryl-3-Chloro-5-Sulfonat--Benzoquinon-Monoimin. Das Reaktionsprodukt wurde spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 546 nm gegen den Reagenzienleerwert gemessen. Zur Quantifizierung diente eine Eichreihe aus H2O2-Standards. 3.7.2 Versuchsdurchführung Die Bestimmung des Abbaus von H2O2 durch Rat-1-Fibroblasten erfolgte durch Messung der extrazellulären Konzentrationen von H2O2 im Überstand. Die Versuche 29 zur Kinetik des H2O2-Abbaus wurden in 6-Well-Zellkulturplatten durchgeführt. Zum Zeitpunkt t=0 wurde H2O2 in einer Endkonzentration von 1 mM zum Krebs-HenseleitPuffer hinzugefügt, der verwendete Krebs-Henseleit-Puffer enthielt wie in allen anderen Versuchsreihen 100 µM DTPA. Hierdurch wurde der eisenkatalysierte Abbau von H2O2 über die Fenton-Reaktion (5) verhindert. 3.7.3 Lösungen und Reagenzien MOPS 50 mM KCl 50 mM KOH 5M 3,5-Dichloro-2-Hydroxybenzensulfonsäure 4,2 mM 4-Aminophenazon 33 mM DTPA 4 mM Peroxidase aus Meerrettich 2500 U/ml 3.8 Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der intrazellulären Ca2+-Konzentration 3.8.1 Prinzip der digitalen Fluoreszenzmikroskopie Die digitale Fluoreszenzmikroskopie ist eine Methode zur Bestimmung von intrazellulären Ionenkonzentrationen und ermöglicht ferner, Veränderungen von Ionenkonzentrationen über einen längeren Zeitraum zu verfolgen. Das Prinzip besteht darin, daß vitale Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff beladen werden, der für ein bestimmtes Ion spezifisch ist und mit dem es eine Komplexbildung eingehen kann. In dieser Arbeit wurde der Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 verwandt, welcher spezifisch für das Ca2+-Ion ist (32) Der Farbstoff wurde zur Beladung der Zellen als membranpermeabler Acetoxymethylester eingesetzt. Intrazellulär werden diese Esterbindungen durch unspezifische Esterasen hydrolysiert, woraufhin der Farbstoff die Zellmembran nicht mehr durchdringen kann und daher intrazellulär akkumuliert. Zusätzlich wurde ein Hemmstoff zellulärer Ionenkanäle, Probenicid (Endkonzentration im Versuchsansatz 2 mM), eingesetzt, wodurch die Retention des Farbstoffes in den Zellen verbessert wurde. Die Zugabe von Pluronic F-127 (0,06% v/v) diente der Lösung des Acetoxymethylesters von Fura-2. Die 30 Fluoreszenzmessungen wurden mit Hilfe eines inversen Mikroskops (IM-35, Zeiss, Oberkochen) und dem ARGUS-50/CA Imaging System (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu-City, Japan) durchgeführt. In dieser Arbeit wurde das FluoreszenzRatio-Prinzip angewandt: Hierbei wurden die mit Farbstoff beladenen Zellen kurz hintereinander mit Licht zweier verschiedener Wellenlängen angeregt, und zwar 340 10 nm und 380 10 nm. Die Emission wurde bei Wellenlängen von 500-530 nm registriert. Bei einer Anregungswellenlänge von 340 10 nm steigt die Emission in Abhängigkeit von der intrazellulären Ca2+-Konzentration, wohingegen die Emission nach Anregung mit 380 10 nm sich nur geringfügig verändert. Die intrazellulären Ca2+-Konzentrationen wurden also nicht über absolute Fluoreszenzintensitäten bestimmt, sondern über das Verhältnis (Ratio) der Fluoreszenzintensitäten nach Anregung mit zwei unterschiedlichen Wellenlängen. Diese Meßmethode hatte den Vorteil, dass die Auswirkung von Störvariablen minimiert wurde, wie z.B. die unterschiedliche zelluläre Beladung, das Ausbleichen des Farbstoffes während der Messung sowie die unterschiedliche Dicke der Zellen. Durch Kalibrierung, welche nach der Methode von Grynkiewicz (32) erfolgte, war es möglich, die intrazellulären Ca2+-Konzentrationen zu quantifizieren. Es gilt folgender Zusammenhang: k * (R-Rmin ) * Sf Ca2+ = ---------------------------(Rmax – R) * Sb k: Dissoziationskonstante von Fura-2 bezüglich Ca2+ (bei 37°C: 224 nM) R: F (340/380 nm) aus Ca2+-Messung Rmax : F (340/380 nm) bei max. Ca2+-Konzentration, aus Kalibrierung Rmin : F (340/380 nm) bei min. Ca2+-Konzentration, aus Kalibrierung Sb: F (380 nm) bei max. Ca2+-Konzentration Sf: F (380 nm) bei min. Ca2+-Konzentration 31 3.8.2 Versuchsdurchführung Für die Bestimmung der intrazellulären Ca2+-Konzentration wurden die Rat-1Fibroblasten auf Deckgläschen kultiviert. Diese wurden für die Messungen in ein Pentz-Kammersystem (Werkstatt, Universitätsklinikum Essen) eingespannt. Vor der Inkubation mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 wurden die Zellen dreimal mit HBSS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in Krebs-Henseleit-Puffer bei 37°C in der Dunkelheit für 30 min inkubiert. Die Endkonzentration des Acetoxymethylesters von Fura-2 betrug 5 µM. Nach 30-minütiger Inkubation wurden die Zellen erneut dreimal mit HBSS gewaschen, um die extrazellulären Farbstoffreste zu entfernen. Unmittelbar danach wurde mit dem Experiment begonnen, welches in KrebsHenseleit-Puffer bei 37°C stattfand. Sämtliche Arbeiten mit dem Fluoreszenzfarbstoff wurden in abgedunkelten Räumen durchgeführt, um das vorzeitige Ausbleichen des Farbstoffes zu minimieren. Zu beachten ist, daß der Zelltod in diesen Versuchen früher eintrat als in den Vitalitätsversuchen oder den Experimenten zur Bestimmung von intrazellulärem Glutathion. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Zellen hier auf Glasplättchen kultiviert wurden und sie ferner während der Versuche der Bestrahlung mit UV-Licht ausgesetzt waren. 3.9 Enzymatische Bestimmung von intrazellulärem Glutathion 3.9.1 Bestimmung von reduziertem Glutathion (GSH) 3.9.1.1 Prinzip der Messung Die Bestimmung der reduzierten Form von Glutathion (GSH) erfolgte entsprechend dem Ansatz der Methodensammlung von E. Bernt & H.U. Bergmeyer (10). Reduziertes Glutathion wird mit Methylglyoxal durch Glyoxalase I quantitativ in SLactosyl-GSH überführt: Glyoxalase I GSH + Methylglyoxal S-Lactosyl-GSH Hierbei wird S-Lactosyl-GSH bei 240 nm direkt photometrisch gemessen. 32 3.9.1.2 Für die Probenaufbereitung und Durchführung der Messungen Bestimmung des GSH-Gehaltes von Rat-1-Fibroblasten wurden Kulturflaschen mit einer Oberfläche von 25 cm 2 verwendet. Die Versuchsansätze enthielten 6,5 ml KH-Puffer mit den im Ergebnisteil angegebenen Endkonzentrationen an H2O2 bzw. Glucose. Die Versuche wurden nach einer Zeitdauer von 0 min, 30 min oder 60 min gestoppt durch die Zugabe von Perchlorsäure (7% w/v, mit 2 mm EDTA). Sofort danach wurde die Zellkulturflasche in flüssigen Stickstoff getaucht. Nach dem Antauen des Zellrasens wurde dieser mit einem Gummispatel abgekratzt, in Eppendorf-Cups überführt und zentrifugiert. Das Pellet wurde auf den Proteingehalt mit der Methode nach Bradford untersucht (siehe dort). Zu dem Überstand wurden 25 µl einer Methylorange-Stammlösung hinzugefügt (0,5 mg/ml in Aqua dest.). Letztere diente als pH-Indikator bei der anschließenden Neutralisierung (auf pH 7,2) mit einer Lösung aus 2 M KOH mit 0,3 M MOPS. Das ausgefallene Kaliumperchlorat wurde abzentrifugiert, anschließend wurden die Proben der spektrophotometrischen Messung zugeführt. Die Messungen wurden in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer bei pH 7,2 durchgeführt. Zu 500 µL Puffer wurden 500 µL Probe und 1,5 µL Glyoxalase I (ca. 1700 U/ml) pipettiert. Die Messung wurde gestartet durch die Zugabe von 20 µL Methylglyoxallösung (110 mM). Die Quantifizierung erfolgte mit Hilfe einer Eichung aus GSH-Standards. 3.9.1.3 Lösungen und Reagenzien Methylglyoxallösung 110 mM Glyoxalase I 1700 U/mL GSH-Standards 10 µM, 50 µM, 100 µM Dikaliumhydrogenphosphat-Lsg. 0,1 M Kaliumdihydrogenphosphat-Lsg. 0,1 M Kaliumhydroxidlösung 2 M mit 0,3 M MOPS Perchlorsäure 7% w/v mit 2 mM EDTA Methylorangelösung 0,5 mg/ml 33 3.9.2 Bestimmung von oxidiertem Glutathion (GSSG) 3.9.2.1 Prinzip der Messung Auch die Bestimmung der oxidierten Form des Glutathion (GSSG) erfolgte entsprechend der Methodensammlung von E. Bernt & H.U. Bergmeyer (10). Oxidiertes Glutathion wird durch reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat (NADPH) mit Glutathion-Reduktase quantitativ zu GSH reduziert: Glutathion-Reduktase GSSG + NADPH + H+ 2 GSH + NADP+ Die Abnahme von NADPH wird anhand der Extinktionsänderung bei 340 nm gemessen. 3.9.2.2 Probenaufbereitung und Versuchsdurchführung GSSG wurde aus dem gleichen Ansatz wie GSH gemessen. Zu 500 µL Puffer wurde 500 µL Probe und 10 µL NADPH (1 mM) pipettiert. Die Messung wurde nach vollständiger Umsetzung von GSH in S-Lactosyl-GSH (s.o.) durch die Zugabe von 5 µL Glutathion-Reduktase (120 U/ml) gestartet. Die Quantifizierung erfolgte mit Hilfe einer Eichreihe aus GSSG-Standards. 3.9.2.3 Lösungen und Reagenzien Glutathion-Reduktase 120 U/ml NADPH 1 mM GSSG-Standards 2,5 µM, 5 µM, 10 µM, 50 µM Pufferlösungen und Lösungen zur Probenaufbereitung wie bei der Bestimmung von reduziertem Glutathion (GSH). 34 3.10 Bestimmung von intrazellulärem Glutathion auf Einzelzellebene 3.10.1 Prinzip der Bestimmung Das Prinzip der intrazellulären Bestimmung von Glutathion beruht auf der Eigenschaft des Fluorophores Monochlorobiman (MCB) an reduziertes, intrazelluläres Glutathion (GSH) zu binden. Diese Bindung wird durch das Enzym Glutathion-S-Transferase (GST) katalysiert. Das entstehende Produkt kann fluoreszenmikroskopisch nachgewiesen werden (76). 3.10.2 Probenaufbereitung und Versuchsdurchführung Zur Durchführung der Experimente wurden Rat-1-Fibroblasten auf Deckgläschen kultiviert. Diese wurden in ein Pentz-Kammersystem (Werkstatt, Universitätsklinikum Essen) eingespannt. Nach der jeweiligen Inkubationszeit unter experimentellen Bedingungen wurden die Zellen dreimal mit HBSS gewaschen und für 25 min bei 37°C in Krebs-Henseleit-Puffer mit 50 µM Monochlorobiman inkubiert. Die intrazelluläre Retention des Reaktionsproduktes wurde durch Zugabe von 2 mM Probenicid verbessert. Nach der Inkubation wurden die Zellen erneut dreimal mit HBSS gewaschen und anschliessend erneut mit Krebs-Henseleit-Puffer bedeckt. Die Fluoreszenzmessungen wurden an einem inversen Mikroskop (Axiovert 135 TV; Zeiss), ausgestattet mit einem Attofluor Imaging System (Atto Instruments, Rockville, MD, USA), durchgeführt. Die Anregungswellenlänge war 380 10 nm, die Emission wurde gemessen bei 460-490 nm. 3.11 Statistik Alle Versuche wurden in Doppelansätzen durchgeführt und drei- bis fünfmal wiederholt. Die angegebenen Werte entsprechen dem Mittelwert Standardabweichung. Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden mit Student´s t-Test für ungepaarte Stichproben durchgeführt (3). Ein p-Wert < 0,05 wurde als signifikant angesehen. 35 4. Ergebnisse 4.1 Expression von Bcl-2 Die Analyse der Genexpression für bcl-2 auf RNA-Ebene („Northern-Blot“-Analyse) zeigte eine deutliche Überexpression in den Zellklonen, welche mit den für das Bcl-2Protein kodierenden Vektoren transfiziert wurden (Rat-1/Bcl-2#1 bzw. Rat-1/Bcl-2#2, Abbildung 2). Die nicht transfizierten Rat-1-Fibroblasten (Rat-1/Wildtyp) sowie die mit dem Kontroll-Vektor transfizierten Rat-1-Fibroblasten (Rat-1/cMycER) zeigten hingegen auf RNA-Ebene keine nennenswerte Expression des bcl-2-Gens In der „Western-Blot“-Analyse zeigten die Zellklone Rat-1/Bcl-2#1 und Rat-1/Bcl-2#2 eine deutliche Expression des Bcl-2-Proteins. Eine Expression des Bcl-2-Proteins konnte hingegen in den Zellklonen Rat-1/Wildtyp und Rat-1/cMycER nicht nachgewiesen werden (Abbildung 3). Da die beiden mit Bcl-2 transfizierten Zellklone keine signifikanten Unterschiede im biologischen Verhalten zeigten, werden nachfolgend nur die Ergebnisse gezeigt, die am Zellklon Rat-1/Bcl-2#2 erzielt wurden. Diese Zellen werden vereinfacht als Rat-1/Bcl-2-Zellen bezeichnet. 4.2 Effekte von Glucose, Quin-2 und der Überexpression von Bcl-2 auf den H2O2-induzierten Zelltod Bei Inkubation von nicht transfizierten Rat-1-Fibroblasten (Rat-1/Wildtyp) in substratfreiem Krebs-Henseleit-Puffer und H2O2 in einer Konzentration von 1 mM, zeigten diese einen Vitalitätsverlust von über 70% innerhalb von 2 Stunden (Abbildung 4 A). Im Gegensatz dazu wurden die mit Bcl-2 transfizierten Rat-1Fibroblasten (Rat-1/Bcl-2) unter gleichen Bedingungen innerhalb von 4 Stunden zu weniger als 15% geschädigt (Abbildung 4 B). Durch die Zugabe von Glucose (10 mM) konnten die nicht transfizierten Fibroblasten nahezu komplett vor der H 2O2induzierten Zellschädigung geschützt werden (Abbildung 4 A), während ein solcher schützender Effekt von Glucose bei den mit Bcl-2 transfizierten Zellen überraschenderweise nicht beobachtet werden konnte (Abbildung 4 B). Ähnlich wie bei den nativen Fibroblasten konnte man bei den Vektorkontroll-Zellen (Rat1/cMycER) einen schützenden Effekt durch die Zugabe von Glucose beobachten (Daten nicht gezeigt). In Abwesenheit von H2O2 konnte man bei allen verwendeten Zellklonen während sechsstündiger Inkubation in Krebs-Henseleit-Puffer keinen nennenswerten Vitalitätsverlust beobachten (Daten nicht gezeigt). 36 Abbildung 2: „Northern-Blot“-Analyse der Expression von bcl-2. Nach der elektrophoretischen Auftrennung von RNA der jeweiligen Zellklone erfolgte der Transfer auf eine Nylonmembran. Der Nachweis erfolgte durch Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten cDNA-Sonde. 37 Abbildung 3: „Western-Blot“-Analyse der Expression von bcl-2. Nach der elektrophoretischen Auftrennung von Gesamtzellproteinextrakten der jeweiligen Zellklone erfolgte der Transfer auf eine Nitrocellulosemembran. Der Nachweis erfolgte immunologisch mit einem Antikörper gegen humanes Bcl-2Protein. Am linken Bildrand sind schematisch die Molekulargewichtsstandards dargestellt (kD). 38 LDH-Freisetzung (%) A) Rat-1/Wildtyp 1 mM H2O2 ohne Glucose 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 mM H2O2 mit Glucose 0 1 2 3 4 5 6 Inkubationszeit (h) LDH-Freisetzung (%) B) Rat-1/Bcl-2 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 mM H2O2 ohne Glucose 1 mM H2O2 mit Glucose 0 1 2 3 4 5 6 Inkubationszeit (h) Abbildung 4: Effekt von Glucose und der Überexpression von Bcl-2 auf den H2O2-induzierten Zelltod. Rat-1/Wildtyp (A) und Rat-1/Bcl-2-Zellen (B) wurden in Krebs-Henseleit-Puffer mit 1 mM H2O2 inkubiert. Glucose wurde bei einem Teil der Ansätze in einer Konzentration von 10 mM zugegeben. Die Zellschädigung wurde anhand der Freisetzung cytosolischer LDH gemessen. Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten S.D. aus vier Experimenten. 39 Die Vorinkubation mit dem intrazellulären Ca2+-Chelator Quin-2 (10 µM) bewirkte während der Inkubation mit 1 mM H2O2 bei den Wildtyp-Fibroblasten einen deutlichen Schutz gegen Zellschädigung (Abbildung 5 A). Dieser Schutzeffekt konnte, wie der Glucose-Effekt, in Bcl-2-transfizierten Zellen nicht beobachtet werden (Abbildung 5 B). 4.3 Effekte von H2O2, Glucose und der Überexpression von Bcl-2 auf den Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration In Abwesenheit von H2O2 blieb die cytosolische Ca2+-Konzentration nach 3 Stunden Inkubation in Krebs-Henseleit-Puffer in allen Zellklonen konstant (Daten nicht gezeigt). Bei Inkubation mit 1 mM H2O2 stieg die cytosolische Ca2+-Konzentration in WildtypFibroblasten innerhalb von 35 min von 53 16 nM auf 515 32 nM an (Abbildung 6 A). Auch in den Vektorkontroll-Zellen kam es zu einem ähnlichen Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration (Abbildung 6 B). In Rat-1/Bcl-2-Zellen hingegen überstieg die cytosolische Ca2+-Konzentration nicht 170 nM (Abbildung 6 C) bevor der Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 aus den Zellen austrat, d.h. bevor die Zellen die Zellmembranintegrität verloren und somit starben. Ein signifikanter Effekt durch die Zugabe von Glucose konnte bei Rat-1/Bcl-2-Zellen nicht gezeigt werden. Jedoch konnte durch die Zugabe von Glucose der H2O2-induzierte Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration sowohl in Wildtyp-Fibroblasten als auch in den VektorkontrollZellen deutlich verzögert werden (Abbildung 6 A, B). Man kann in erster Schlußfolgerung daher vermuten, daß das Bcl-2-Protein, ähnlich wie Glucose, gegen die Ca2+-abhängige Komponente der H2O2-Toxizität zu schützen vermag. 4.4 Kinetik des zellulären H2O2-Abbaus von Rat-1-Fibroblasten Als nächstes galt es, den schützenden Effekt der Glucose in Wildtyp-Fibroblasten und Vektorkontroll-Zellen näher zu untersuchen, ebenso wie die Tatsache, daß dieser schützende Effekt in Bcl-2-transfizierten Zellen nicht beobachtet werden konnte. Daher bedurfte es einer näheren Betrachtung hinsichtlich der Kinetik des intrazellulären H2O2-Abbaus. Es stellte sich hierbei heraus, daß die Kinetik des H 2O2Abbaus in allen Zellklonen gleich und bei den eingesetzten Konzentrationen von 1 mM H2O2 unabhängig von der Anwesenheit von Glucose war (Abbildung 7). 40 A) Rat-1/Wildtyp 1 mM H2O2 ohne Quin-2 100 LDH-Freisetzung (%) 90 80 70 60 50 40 30 1 mM H2O2 mit Quin-2 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 Inkubationszeit (h) B) Rat-1/Bcl-2 100 LDH-Freisetzung (%) 90 80 70 60 50 1 mM H2O2 mit Quin-2 40 30 1 mM H2O2 ohne Quin-2 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 Inkubationszeit (h) Abbildung 5: Effekt des Ca2+-Chelators Quin-2 auf den H2O2-induzierten Zelltod. Rat-1/Wildtyp (A) und Rat-1/Bcl-2-Zellen (B) wurden in Krebs-Henseleit-Puffer (ohne Glucose) mit 1 mM H2O2 inkubiert. Quin-2-AM (10 µM) wurde 1 h vor Beginn des Experimentes zugegeben. Die Zellschädigung wurde anhand der Freisetzung cytosolischer LDH gemessen. Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten S.D. aus vier Experimenten. 41 Cytosolische Ca2+-Konzentration (nM) A) Rat-1/Wildtyp 600 500 400 H2O2 1 mM 300 H2O2 1 mM + Glucose 200 100 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Inkubationszeit (min) Cytosolische Ca2+-Konzentration (nM) B) Rat-1/cMycER 600 500 400 H2O2 1 mM 300 200 H2O2 1 mM + Glucose 100 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Inkubationszeit (min) 42 Cytosolische Ca2+-Konzentration (nM) C) Rat-1/Bcl-2 600 500 400 300 H2O2 1 mM 200 100 H2O2 1 mM + Glucose 0 0 10 5 15 20 25 30 35 40 Inkubationszeit (min) Abbildung 6: Effekte von Glucose auf den H2O2-induzierten Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration. Rat-1/Wildtyp (A), Rat-1/cMycER (B) und Rat-1/Bcl-2 Zellen (C) wurden in KrebsHenseleit Puffer (mit oder ohne 10 mM Glucose) mit 1 mM H2O2 inkubiert. Die cytosolische Ca2+-Konzentration wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie und dem Ca2+-Indikator Fura-2 bestimmt. Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten S.D. aus vier Experimenten. 43 H2O2-Konzentration (mM) A) Rat-1/Wildtyp 1 0,9 0,8 0,7 ohne Glucose mit Glucose (10 mM) 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 20 40 60 80 100 120 Inkubationszeit (min) H2O2-Konzentration (mM) B) Rat-1/cMycER 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 ohne Glucose mit Glucose (10 mM) 0 20 40 60 80 100 120 Inkubationszeit (min) 44 H2O2-Konzentration (mM) C) Rat-1/Bcl-2 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 ohne Glucose mit Glucose (10 mM) 0 20 40 60 80 100 120 Inkubationszeit (min) Abbildung 7: Kinetik des H2O2-Abbaus. Rat-1/Wildtyp (A), Rat-1/cMycER (B) und Rat-1/Bcl-2-Zellen (C) wurden in KrebsHenseleit-Puffer mit oder ohne Glucose (10 mM) in Anwesenheit von 1 mM H 2O2 inkubiert. Die Bestimmung der Konzentration von H2O2 im Überstand erfolgte spektrophotometrisch entsprechend dem Ansatz von Fossati et al. (26). Die gezeigten Werte entsprechen den Mittelwerten S.D. aus vier Experimenten. 45 Daher konnte eine unterschiedliche Kinetik des zellulären H2O2-Abbaus nicht zur Erklärung hinsichtlich der differierenden Sensitivität gegenüber der H 2O2-induzierten Schädigung der einzelnen Zellklone herangezogen werden. 4.5 Effekte von H2O2 und Glucose auf den zellulären ATP-Gehalt von Rat-1Fibroblasten Es mußte weiterhin ausgeschlossen werden, daß der protektive Effekt von Bcl-2 und Glucose gegenüber H2O2-induzierter Zellschädigung auf eine verbesserte ATPVersorgung zurückzuführen ist. In allen untersuchten Zellklonen sank der intrazelluläre ATP-Spiegel innerhalb von 60 min um ca. 40%. Der ATP-Gehalt und auch die Kinetik des intrazellulären ATP-Abfalls wurde durch die Anwesenheit von Glucose nicht signifikant verändert (Abbildung 8). 4.6 Effekte von Bcl-2, H2O2 und Glucose auf den Gehalt an GSH und GSSG von Rat-1-Fibroblasten Da Glucose nicht die Kinetik des H2O2-Abbaus oder die ATP-Versorgung der Zellen beeinflusste, könnte eine verbesserte Bereitstellung von NADPH über den Pentosephosphatweg und die dadurch verbesserte Reduktion von GSSG eine mögliche Erklärung für den protektiven Effekt von Glucose bieten. Daher galt es als nächstes zu untersuchen, ob Glucose und/oder Bcl-2 zu veränderten intrazellulären Glutathion-Spiegeln führten. Mit Bcl-2 transfizierte Zellen zeigten im Vergleich zu Rat-1/Wildtyp-Fibroblasten und auch den Vektorkontroll-Zellen (Rat-1/cMycER) 1,6fach höhere Spiegel an reduziertem Glutathion (Abbildung 9 A). Nach Inkubation mit 1 mM H2O2 kam es zu einem deutlichen Abfall von Glutathion in Rat-1/Wildtyp- und Rat-1/cMycER-Zellen (Abbildung 9 A). Dieser deutliche Abfall zeigte sich nicht in Rat-1/Bcl-2-Zellen, hier war der relative Abfall von GSH deutlich geringer und auch der absolute Abfall schien weniger ausgeprägt zu sein, obwohl die Differenz in den absoluten Werten keine Signifikanz erreichte. Darüberhinaus war nach Inkubation mit 1 mM H2O2 der relative (und auch der absolute) Anstieg von GSSG in Rat-1/Wildtyp und Rat-1/cMycER Zellen höher als in Rat-1/Bcl-2 Zellen (Abbildung 9 B). Das GSSG/GSH Ratio war daher in den Rat-1/Bcl-2-Zellen, verglichen mit den Wildtyp-Zellen bzw. den Vektorkontroll-Zellen wesentlich geringer (Tabelle 2). 46 A) Rat-1/Wildtyp ATP-Gehalt (nmol/106 Zellen) 6 5 4 3 2 1 0 Kontrolle 30 min 30 min 60 min + Glucose 60 min + Glucose B) Rat-1/cMycER ATP-Gehalt (nmol/106 Zellen) 6 5 4 3 2 1 0 Kontrolle 30 min 30 min + Glucose 60 min 60 min + Glucose 47 C) Rat-1/Bcl-2 ATP-Gehalt (nmol/106 Zellen) 6 5 4 3 2 1 0 Kontrolle Abbildung 8: 30 min 30 min + Glucose 60 min 60 min + Glucose Effekte von H2O2 und Glucose auf den zellulären ATP- Gehalt von Rat-1-Fibroblasten Rat-1/Wildtyp (A), Rat-1/cMycER (B) und Rat-1/Bcl-2-Zellen (C) wurden in KrebsHenseleit-Puffer in Gegenwart von 1 mM H2O2 mit oder ohne Glucose (10 mM) inkubiert. Der zelluläre ATP-Gehalt wurde mit Hilfe der Kapillarelektrophorese bestimmt. Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten S.D. aus vier Experimenten 48 100 GSH (nmol/mg Protein) 90 A) Rat-1/Wildtyp Rat-1/cMycER 80 Rat-1/Bcl-2 70 60 50 40 30 20 10 0 Kontrolle1 25 B) 2 H2O2 330 min 4 min H2O2 30 + Glucose Rat-1/Wildtyp GSSG (nmol/mg Protein) Rat-1/cMycER 20 Rat-1/Bcl-2 15 10 5 0 1 Kontrolle Abbildung 9: 2 3 H2O2 30 min 4 H2O2 30 min + Glucose Effekte von Bcl-2, H2O2 und Glucose auf den Gehalt von GSH und GSSG von Rat-1-Fibroblasten. Rat-1/Wildtyp, Rat-1/Bcl-2-Zellen und die Vektorkontroll-Zellen Rat-1/cMycER wurden in Krebs-Henseleit-Puffer (mit oder ohne 10 mM Glucose) und 1 mM H2O2 inkubiert. Zu den angegebenen Zeiten wurden die Zellen lysiert und mit Perchlorsäure deproteiniert. Die Bestimmung von GSH (A) und GSSG (B) erfolgte enzymatisch. Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten S.D. aus vier Experimenten. 49 Rat-1/Wildtyp Rat-1/cMycER Rat-1/Bcl-2 Kontrolle 0,10 0,01 0,11 0,02 0,07 0,01 H2O2 30 min H2O2 30 min + Glucose 0,65 0,06 0,16 0,03 0,67 0,19 0,17 0,04 0,15 0,04 0,13 0,02 H2O2 60 min H2O2 60 min + Glucose 1,46 0,70 0,82 0,09 1,60 0,51 0,87 0,48 0,85 0,23 0,68 0,24 Tabelle 2: GSSG/GSH-Ratio bei Inkubation mit H2O2 Rat-1/Wildtyp, Rat-1/cMycER und Rat-1/Bcl-2-Zellen wurden in Krebs-HenseleitPuffer mit 1 mM H2O2 mit oder ohne Glucose inkubiert. Die Bestimmung von GSH und GSSG erfolgte enzymatisch. Die gezeigten Werte entsprechen den Mittelwerten S.D aus den jeweiligen Quotienten von GSSG/GSH aus vier Experimenten. Der Zusatz von Glucose verlangsamte bei Rat-1/Wildtyp-Zellen und in den Vektorkontroll-Zellen (Rat-1/cMycER) den Abfall von GSH bzw. den Anstieg von GSSG, dagegen wurde in Bcl-2-transfizierten Zellen kein Einfluß von Glucose auf den GSH- oder den GSSG-Spiegel festgestellt (Abbildung 9 A, B). 4.7 Bestimmung des intrazellulären Glutathion-Gehaltes auf Einzelzellebene Um eine Aussage darüber zu machen, ob eine Heterogenität des intrazellulären GSH-Gehaltes zwischen den einzelnen Zellen besteht (z.B. aufgrund unterschiedlicher Stadien des Zellzyklus) bzw. ob eine Kompartimentierung von GSH innerhalb der Zellen stattfindet, wurde die Bestimmung von intrazellulärem Glutathion auch auf Einzelzellebene wiederholt, und zwar unter Einsatz des Fluoreszenzfarbstoffes Monochlorobiman (MCB). Diese Messungen bestätigten die Ergebnisse, welche mit der spektrophotometrischen Analyse erzielt wurden, d.h. auch hier zeigten die mit Bcl-2 transfizierten Zellen einen höheren GSH-Spiegel und der GSH-Abfall nach Inkubation mit 1 mM H2O2 war auch hier deutlich langsamer als in den Rat-1/Wildtyp-Zellen bzw. in den Vektorkontroll-Zellen (Abbildung 10). Ferner konnte gezeigt werden, dass eine Heterogenität im GSH Gehalt ebensowenig wie eine Kompartimentierung innerhalb der Zellen bestanden hat (Abbildung 11 A und B). 50 Fluoreszenzintensität (arbitrary units) 160 Rat-1/Wildtyp Rat-1/cMycER Rat-1/Bcl-2 140 120 100 80 60 40 20 0 Kontrolle Kontrolle Abbildung 10: 30 H2O2 H2min O2 30 min 30 H2O2 H2min O2 30 min+ Glucose + Glucose Effekte von Bcl-2 und Glucose auf den intrazellulären Glutathiongehalt von Rat-1-Fibroblasten. Bestimmung auf Einzelzellebene. Rat-1/Wildtyp, Rat-1/cMycER und Rat-1/Bcl-2-Zellen wurden in Krebs-HenseleitPuffer mit oder ohne Glucose (10 mM) in Anwesenheit von 1 mM H 2O2 inkubiert. Die Bestimmung des intrazellulären Glutathion auf Einzelzellebene erfolgte fluoreszenzmikroskopisch unter Einsatz des Glutathion-spezifischen Farbstoffes Monochlorobiman. Die gezeigten Werte entsprechen den Mittelwerten S.D. aus drei Experimenten. 51 A 10 µm B 10 µm Abbildung 11: Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung von intrazellulärem Glutathion auf Einzelzellebene Rat-1/Wildtyp (A) und Rat-1/Bcl-2-Zellen (B) wurden für 25 min mit Monochlorobiman (50 µM) inkubiert. Dargestellt sind die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen, repräsentativ für 4 Versuche. Anregungswellenlänge: 380 10 nm, Emissionswellenlänge: 460-490 nm. 52 Man kann also die Schlußfolgerung ziehen, daß Glucose und das Bcl-2-Protein ihre protektive Wirkung möglicherweise über den gleichen Mechanismus entfalten, nämlich die Verbesserung der Glutathion-abhängigen antioxidativen Kapazität der Zellen. Diese Hypothese würde auch eine Erklärung dafür liefern, warum Glucose in Bcl-2-transfizierten Zellen keinen zusätzlichen Schutzeffekt zeigt, da letztere aufgrund der Wirkung des Bcl-2 Proteins bereits einen hinreichend hohen Glutathionspiegel aufweisen und damit auch eine verbesserte antioxidative Kapazität. 4.8 Effekte von N-Acetylcystein auf die Vitalität, den H2O2-induzierten Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration und den Glutathion-Gehalt von Rat-1-Fibroblasten. Die Glutathionhomöostase schien also eine Schlüsselrolle im Mechanismus der Wirkung des Bcl-2-Proteins zu spielen, daher war es notwendig, diesen Aspekt näher zu beleuchten, indem als nächstes die intrazellulären Glutathionspiegel manipuliert wurden. Durch Vorinkubation von Rat-1/Wildtyp und Rat-1/cMycER-Zellen mit 40 mM N-Acetylcystein (NAC) wurde der GSH-Abfall bei Inkubation mit 1 mM H2O2 deutlich verlangsamt (Abbildung 12). Unter diesen Bedingungen konnte ein deutlicher Schutzeffekt hinsichtlich des Vitalitätsverlustes in Rat-1/Wildtyp und Rat-1/cMycERZellen erzielt werden (Abbildung 13). Ferner wurde durch Vorinkubation mit 40 mM NAC der Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration bei H2O2-Exposition stark vermindert (Abbildung 14). 4.9 Effekte von BSO auf die Vitalität, den H2O2-induzierten Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration und den Glutathion-Gehalt von Rat-1Fibroblasten. Auf der anderen Seite konnte der intrazelluläre Glutathionspiegel durch zehnstündige Vorinkubation in Zellkulturmedium mit 0,5 mM BSO deutlich gesenkt werden (Abbildung 15). BSO bewirkt eine Reduktion des Glutathionspiegels durch Hemmung der -Glutamylcystein-Synthetase, welche das Schlüsselenzym der intrazellulären Glutathionsynthese darstellt. Wenn in Bcl-2-transfizierten Zellen auf diese Weise der Glutathionspiegel gesenkt wurde, zeigten diese einen schnellen und ausgeprägten Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration nach Zugabe von 1 mM H2O2 (Abbildung 16). 53 100 A) Rat-1/Wildtyp GSH (nmol/mg Protein) 90 Vorinkubation mit 40 mM NAC 80 ohne Vorinkubation 70 60 50 40 30 20 10 0 0 30 60 Inkubationszeit (min) 100 GSH (nmol/mg Protein) 90 B) Rat-1/cMycER Vorinkubation mit 40 mM NAC 80 ohne Vorinkubation 70 60 50 40 30 20 10 0 0 30 60 Inkubationszeit (min) Abbidung 12: Beeinflussung von zellulärem Glutathion durch Vorinkubation von Rat-1-Fibroblasten mit N-Acetylcystein. Rat-1/Wildtyp (A) und Rat-1/cMycER Zellen (B) wurden für 1 h mit 40 mM NAcetylcystein vorinkubiert. Anschliessend erfolgte die Inkubation in Gegenwart von 1 mM H2O2 in Krebs-Henseleit-Puffer. Die Bestimmung von GSH erfolgte enzymatisch. Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten S.D. aus drei Experimenten. 54 100 Vorinkubation mit 40 mM NAC ohne Vorinkubation 90 LDH-Freisetzung (%) 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Rat-1/Wildtyp Abbildung 13: Rat-1/cMycER Effekt von N-Acetylcystein auf die Vitalität von Rat-1/Wildtyp und Rat-1/cMycER-Zellen. Rat-1/Wildtyp und Rat-1/cMycER-Zellen wurden für 1 h mit 40 mM N-Acetylcystein vorinkubiert oder nicht vorbehandelt. Anschliessend erfolgte die Inkubation in KrebsHenseleit-Puffer mit 1 mM H2O2. Nach 6 h wurde die Zellschädigung anhand der Freisetzung cytosolischer LDH gemessen. Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten S.D. aus drei Experimenten. 55 Cytosolische Ca2+-Konzentration (nM) 600 500 1 mM H2O2 ohne N-Acetylcystein 400 1 mM H2O2 mit N-Acetylcystein 300 200 100 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Inkubationszeit (min) Abbildung 14: Effekt von N-Acetylcystein auf den H2O2-induzierten Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration in Rat-1-Fibroblasten. Rat-1/Wildtyp-Zellen wurden in Krebs-Henseleit-Puffer (ohne Glucose) mit 1 mM H2O2 inkubiert. N-Acetylcystein wurde in einer Konzentration von 40 mM 1 h vor Beginn des Experimentes zugegeben. Die cytosolische Ca2+-Konzentration wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie und dem Ca2+-Indikator Fura-2 bestimmt. Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten S.D. aus vier Experimenten. 56 100 90 GSH (nmol/mg Protein) 80 70 60 50 40 30 20 10 0 ohne 1 Vorinkubation Abbildung 15: Vorinkubation 2 mit BSO Effekt von BSO auf den zellulären Gehalt an Glutathion in Rat-1/Bcl-2-Zellen. Rat-1/Bcl-2-Zellen wurden für 10 h in Krebs-Henseleit-Puffer in Gegenwart von 0,5 mM BSO inkubiert oder nicht vorbehandelt. Die Bestimmung von GSH erfolgte enzymatisch. Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten S.D. aus drei Experimenten. 57 Cytosolische Ca2+-Konzentration (nM) 600 500 400 1 mM H2O2 vorbehandelt mit BSO 300 1 mM H2O2 nicht vorbehandelt 200 100 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Inkubationszeit (min) Abbildung 16: Effekt von BSO auf den H2O2-induzierten Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration in Rat-1/Bcl-2-Zellen. Rat-1/Bcl-2-Zellen wurden für 10 h mit 0,5 mM BSO vorinkubiert und in Krebs- Henseleit-Puffer (ohne Glucose) mit 1 mM H2O2 inkubiert. Die cytosolische Ca2+Konzentration wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie und dem Ca2+-Indikator Fura-2 bestimmt. Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten S.D. aus vier Experimenten. 58 Ferner zeigten diese glutathiondepletierten Zellen einen ausgeprägten Vitalitätsverlust bei Inkubation mit 1 mM H2O2 (Abbildung 17). Diese Ergebnisse unterstützen demnach die Annahme, daß das Bcl-2-Protein nicht direkt auf intrazelluläre Ca2+-Ströme wirkt, sondern vielmehr auf einen vorgeschalteten Mediator, nämlich das intrazelluläre Glutathion. Darüberhinaus kann man folgern, dass in dem hier gezeigten Zellschädigungsmodell der intrazelluläre Ca2+-Anstieg stark abhängig ist vom jeweiligen Glutathiongehalt und Redox-Zustand der Zellen und somit die intrazellulären Ca2+-Verschiebungen über Glutathionabhängige Prozesse reguliert werden. 4.10 Effekte erhöhter H2O2-Konzentrationen auf die Vitalität und den H2O2induzierten Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration von Rat-1/Bcl-2-Zellen. Wenn hohe initiale Spiegel an zellulärem Glutathion und die verbesserte Aufrechterhaltung der Glutathion-Redoxbalance in den Bcl-2-transfizierten Zellen der Grund für die höhere Resistenz dieser Zellen gegenüber einer Schädigung durch H2O2 sind, und nicht etwa grundsätzliche Unterschiede in der Ca 2+-Homöostase der Zellen, dann sollte es möglich sein, diese erhöhte Resistenz mit dem Einsatz von höheren H2O2-Konzentrationen zu durchbrechen. Daher wurden als nächstes die Bcl-2-transfizierten Zellen mit 3 mM H2O2 inkubiert. Bei diesen Konzentrationen konnte ein schneller Anstieg des cytosolischen Ca2+ beobachtet werden (Abbildung 18). Bei dieser höheren H2O2-Konzentration waren sowohl Quin-2 (10 µM), als auch Glucose (10 mM) protektiv, obwohl bei Einsatz von 1 mM H2O2 kein Schutzeffekt durch Quin-2 oder Glucose festgestellt werden konnte (Abbildung 19 A und B). Der Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration und der darauffolgende Zelluntergang sind demnach abhängig vom zellulären Glutathionstatus und das Bcl-2-Protein scheint seinen protektiven Effekt durch Verbesserung des antioxidativen Potentials auszuüben, ohne einen direkten Effekt auf die Ca2+-Homöostase. 59 100 LDH-Freisetzung (%) 90 80 70 Vorinkubation mit BSO 60 50 40 30 ohne Vorinkubation 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 Inkubationszeit (h) Abbildung 17: Effekt von BSO auf den Vitalitätsverlust von Rat-1/Bcl-2-Zellen. Rat-1/Bcl-2-Zellen wurden für 10 h mit 0,5 mM BSO vorinkubiert und anschliessend in Krebs-Henseleit-Puffer (ohne Glucose) mit 1 mM H2O2 inkubiert. Die Zellschädigung wurde anhand der Freisetzung cytosolischer LDH gemessen. Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten S.D. aus vier Experimenten. 60 Cytosolische Ca2+-Konzentration (nM) 600 500 400 3 mM H2O2 300 200 100 1 mM H2O2 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Inkubationszeit (min) Abbildung 18: Effekt einer erhöhten H2O2-Konzentration auf den H2O2-induzierten Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration in Rat-1/Bcl-2Zellen. Rat-1/Bcl-2-Zellen wurden in Krebs-Henseleit-Puffer mit 1 mM oder 3 mM H2O2 inkubiert. Die cytosolische Ca2+-Konzentration wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie und dem Ca2+-Indikator Fura-2 bestimmt. Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten S.D. aus vier Experimenten. 61 100 A) LDH-Freisetzung (%) 90 80 H2O2 3 mM ohne Quin-2 70 60 50 40 30 H2O2 3 mM mit Quin-2 20 10 0 0 2 4 6 Inkubationszeit (h) 100 B) LDH-Freisetzung (%) 90 80 H2O2 3 mM ohne Glucose 70 60 50 40 30 H2O2 3 mM mit Glucose 20 10 0 0 2 4 6 Inkubationszeit (h) Abbildung 19: Effekt einer erhöhten H2O2-Konzentration auf die Zellschädigung von Rat-1/Bcl-2-Zellen. Rat-1/Bcl-2-Zellen wurden in Krebs-Henseleit-Puffer in Gegenwart von 3 mM H2O2 mit oder ohne Quin-2 (10 µM) (A), bzw. mit oder ohne Glucose (10 mM) (B) inkubiert. Die Zellschädigung wurde anhand der Freisetzung cytosolischer LDH gemessen. Die gezeigten Daten entsprechen den Mittelwerten S.D. aus vier Experimenten. 62 5. Diskussion 5.1 H2O2, Glutathion und Calciumhomöostase Zwei wohlbekannte Ereignisse im Zusammenhang mit dem durch H 2O2 induzierten Zelltod sind der Zusammenbruch der zellulären Ca2+-Homöostase sowie die Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern (z. B. dem endoplasmatischen Retikulum) in das Cytosol (68, 69, 73). Der Anstieg der cytosolischen Ca2+Konzentration spielt offensichtlich ebenso eine entscheidende Rolle bei der cytotoxischen Wirkung von H2O2 auf nicht Bcl-2-transfizierte Rat-1-Fibroblasten: nach Zugabe von H2O2 konnte ein schneller und deutlicher Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration beobachtet werden (Abbildung 6) wobei der Ca2+-Chelator Quin2 effektiv vor dem Zelltod schützte. In dem Ca2+-abhängigen Weg der oxidativen Zellschädigung spielt der zelluläre Glutathionstatus offenbar eine entscheidende Rolle hinsichtlich des cytosolischen Ca2+-Anstiegs. Die Ca2+-Homöostase der Zelle wird aufrechterhalten durch ein komplexes System von Transportproteinen, welche in den Membranen des endoplasmatischen Retikulums, der Mitochondrien sowie der Zellkern- und der Plasmamembran der Zelle lokalisiert sind. Glutathion wiederum spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Redox-Balance von ThiolGruppen dieser Transportproteine (8, 9, 20, 42). An PC 12-Zellen konnte gezeigt werden, dass eine Abnahme des zellulären Glutathions zu Ca 2+-vermitteltem Zelltod führte (43), ferner beobachteten andere Gruppen nach Glutathiondepletion von Thymozyten einen Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration und die Auslösung von Apoptose (54). In der vorliegenden Studie führte die Inkubation von Rat-1Fibroblasten (Wildtyp) mit H2O2 zu einem deutlichen Abfall von GSH, bei gleichzeitigem Anstieg von GSSG (Abbildung 9 A und B). Darüberhinaus konnte nach Stabilisierung des zellulären GSH-Pools mit N-Acetylcystein ein signifikanter Schutzeffekt gegenüber dem Anstieg von intrazellulärem Ca 2+ und dem H2O2vermittelten Zelltod beobachtet werden. Insofern sind diese Ergebnisse gut mit den oben genannten Arbeiten vereinbar. In Gegenwart von Glucose war sowohl der H 2O2-induzierte Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration als auch die Zellschädigung an sich deutlich verzögert. Wie bereits für L929-Fibroblasten beschrieben (52), resultiert dieser protektive Effekt von Glucose aus der Beeinflussung des Glutathion-Redoxzyklus. In diesem Zyklus erfolgt die Bildung von GSSG durch die katalytische Aktivität der GSH-Peroxidase, welches 63 durch die GSH-Reduktase wieder zu GSH reduziert wird. Das für diese Reaktion notwendige NADPH wird vornehmlich aus dem Metabolismus von Glucose im Pentosephosphatweg bereitgestellt. Die hier vorliegenden Ergebnisse passen insofern gut in das beschriebene Konzept, weil die Zugabe von Glucose einerseits den Abfall des reduzierten Glutathions verzögerte und andererseits den GSSG/GSHQuotienten erniedrigte (Abbildung 9 A und B). Zusammenfassend hemmt Glucose demnach den Ca2+-abhängigen Weg der H2O2-vermittelten Zellschädigung wahrscheinlich durch den Effekt auf den Glutathion-Redoxzyklus. In Säugerzellen sind vor allem zwei antioxidative Mechanismen am Abbau von intrazellulärem H2O2 beteiligt. Erstens die durch Katalasen vermittelte Konversion von H2O2 zu molekularem Sauerstoff und Wasser und zweitens das GlutathionPeroxidase/Glutathion-Reduktase-System. Wie oben bereits erwähnt, erfolgt hierbei durch die Glutathion-Peroxidase die Oxidation von GSH zu GSSG unter Verbrauch von H2O2. Glutathion-Reduktase wiederum regeneriert GSH aus GSSG unter Verbrauch des Reduktionsäquivalentes NADPH (5). Der protektive Effekt von Glucose wurde in zurückliegenden Arbeiten auf eine beschleunigte Degradation von H2O2 durch die Glutathion-Peroxidase zurückgeführt (50). In der vorliegenden Arbeit war die Degradation von H2O2 unabhängig von der Anwesenheit von Glucose, was darauf hindeutet, dass der Prozess des H 2O2Abbaus vor allem durch die Aktivität der Katalase unterhalten wird. Darüber hinaus waren die ATP-Spiegel unabhängig von der Anwesenheit von Glucose. Daher kann ein beschleunigter H2O2-Abbau oder eine verbesserte Bereitstellung von Energieträgern in der Zelle nicht den protektiven Effekt von Glucose erklären. 5.2 Der Schutzeffekt von Bcl-2 Der protektive Effekt des Bcl-2-Proteins gegenüber H2O2-induzierter Zellschädigung zeigt bemerkenswerte Analogien zum protektiven Effekt von Glucose: In den mit Bcl-2 transfizierten Zellen trat der Zelluntergang deutlich später ein und der Anstieg der cytosolischen Ca2+ Konzentration war nur gering ausgeprägt (Abbildung 6). Passend zu diesem Befund zeigte der Ca2+-Chelator Quin-2 bei diesen Zellen keinen Schutzeffekt. Darüberhinaus führte die Überexpression des Bcl-2-Proteins zu einer Erhöhung der Gesamtmenge an Glutathion sowie zu einem geringeren Abfall von GSH bei H2O2-Exposition (Abbildung 9). Die Folgerung hieraus ist, dass Bcl-2 vor Zelltod schützt, indem es den Ca2+-abhängigen Weg der H2O2-vermittelten Toxizität 64 hemmt. Dieser Schutzeffekt ist hinreichend erklärbar durch die Aufrechterhaltung der zellulären Glutathionhomöostase. In der vorliegenden Arbeit ergeben sich jedoch noch weitere Hinweise auf eine enge physiologische Verknüpfung zwischen der Ca2+- und der Glutathionhomöostase: Nach Verminderung von zellulärem Glutathion durch BSO, führte die anschließende Inkubation mit 1 mM H2O2 zu einem pathologischen Ca2+-Anstieg auch in den Bcl-2-transfizierten Zellen (Abbildung 16). Ferner war es möglich, die erhöhte antioxidative Kapazität der Bcl-2-Transfektanten zu durchbrechen, indem die Zellen einem erhöhten oxidativen Stress ausgesetzt wurden: Bei Inkubation mit 3 mM H2O2 stieg das cytosolische Ca2+ deutlich an (Abbildung 18) und Quin-2 zeigte in diesen Fällen protektive Effekte. Die Beobachtung, dass Bcl-2 nicht direkt die intrazelluläre Ca2+-Kompartimentierung oder die Ca2+-Ströme an intrazellulären Membranen reguliert, sondern die Sensitivität gegenüber Ca2+-abhängigen Zellschädigungsprozessen indirekt über das zelluläre Glutathion moduliert, kann dazu beitragen, die widersprüchlichen Ergebnisse in Bezug auf die Wirkung von Bcl-2 auf die zelluläre Ca2+-Homöostase zu vereinen (6, 11, 18, 19, 33, 56, 65, 79, 99). Entsprechend den Beobachtungen in dieser Arbeit sollte Bcl-2 nur solche Ca2+-vermittelten Zellschädigungsprozesse beeinflussen, welche durch Veränderung in der Glutathionhomöostase getriggert werden. Nicht GSH-abhängige Prozesse sollten hingegen von der Bcl-2-Expression unbeeinflusst bleiben. Diese Hypothese muss allerdings noch in anderen Zellsystemen überprüft werden. 5.3 Bcl-2 und zelluläres Glutathion Effekte von Bcl-2 auf zelluläres Glutathion wurden bereits in verschiedenen Zelltypen beschrieben, jedoch wurden diese nicht im Zusammenhang mit der zellulären Ca 2+Homöostase betrachtet. Die beschriebenen Effekte beinhalten u.a. die Hochregulierung von zellulärem Glutathion, eine erhöhte Resistenz gegenüber einer Apoptose aufgrund eines reduktiven Shift des zellulären Redox-Gleichgewichtes und die Umverteilung von GSH in den Zellkern mit konsekutivem Schutz gegenüber DNAFragmentation (21, 61, 64, 90, 93, 95). Trotz der vielen Arbeiten über Bcl-2 und Glutathion ist noch immer unklar, über welchen Mechanismus Bcl-2 den zellulären Glutathionmetabolismus verändert. Bei der Diskussion der Zusammenhänge von Bcl-2 und zellulärem Glutathion ist es sinnvoll, diese in drei Gruppen zu unterteilen: 65 - direkte Effekte von Bcl-2 auf zelluläre Glutathionspiegel, z. B. durch die Beeinflussung des Importes oder des Effluxes von GSH - Effekte von Bcl-2 auf andere Parameter als Glutathion, die aber möglicherweise über Glutathion vermittelt werden, z. B. die mitochondriale Permeabilitätserhöhung - Effekte, die auf zelluläres Glutathion rückwirken können, z.B. die Entkoppelung der Atmungskette oder die transkriptionelle Regulation von zellulären Enzymen. Bei den direkten Effekten von Bcl-2 auf zelluläre Glutathionspiegel ist zwischen Veränderungen der zellulären Basalspiegel von GSH und der Verlangsamung des GSH-Abfalls unter Stress-Bedingunen zu unterscheiden. Eine erhöhte Aktivität der cytosolischen GSH-Synthetase, dem Schlüsselenzym der Glutathionsynthese, wurde bisher nicht konsistent beobachtet. Eine andere Möglichkeit, den intrazellulären Basalspiegel von GSH zu erhöhen, ist die Erhöhung des Importes. GSH selbst kann nicht die Zellmembran passieren. Um den Transport von GSH in die Zelle zu ermöglichen, wird GSH durch -Glutamyl-Transferase (GGT) in Glutaminsäure und Cysteinylglycin hydrolysiert, anschliessend erfolgt die Spaltung in die drei GSHbildenden Aminosäuren Glutamat, Cystein und Glycin durch eine membranständige Dipeptidase. Die freien Aminosäuren können in die Zelle eintreten und zur Bildung des Glutathion-Pools beitragen (60, 96). DNA-Chip-Analysen zeigen eine signifikante Erhöhung von GGT in Bcl-2-exprimierenden Zellen (96). Eine Erklärung für den nur gering ausgeprägten Abfall von GSH könnte die Verhinderung des GSH-Effluxes über die Zellmembran sein, so wie es für Bcl-2 und Bcl-xL, einem Protein aus der Bcl-2 Familie, beschrieben wurde (12, 28). Ein Effekt von Bcl-2, der möglicherweise über Glutathion vermittelt wird ist die inhibitorische Wirkung auf die Öffnung der sog. „mitochondrial permeability transition pore“ (MPT-Pore) (31, 48, 57, 92). Diese „MPT-Pore“ entspricht einem Multiproteinkomplex, dessen zentrale Pore aus dem Adenin-Nukleotid-Translokator (ANT), einem Transmembranprotein in der inneren mitochondrialen Membran, und aus einem Protein der äußeren mitochondrialen Membran, namentlich dem „voltagedependent anion channel“ (VDAC), gebildet wird. Andere zu diesem Komplex gehörende Proteine sind der periphere Benzodiazepinrezeptor und Cyclophilin D (30, 66 83, 98). Die MPT kann durch die Oxidation von mitochondrialen Pyridin-Nukleotiden ausgelöst werden (46, 97). Der Redox-Status von NADPH wiederum ist über das Glutathion-Reduktase- und das Thioredoxin-Reduktase-System eng assoziiert mit dem Redox-Status von Glutathion und von Protein-Thiolen. Es konnte gezeigt werden, dass hohe Spiegel an reduziertem Glutathion eine Hemmung der MPT bewirken (44), während Glutathion- und nachfolgende Thiol-Oxidation zur Öffnung der MPT-Pore führen (4, 46, 80). Es wurden zwei experimentell unterscheidbare, redoxsensitive Stellen innerhalb der MPT-Pore beschrieben. Eine von ihnen befindet sich im Redoxgleichgewicht mit Pyridinnukeotiden, die andere im Redoxgleichgewicht mit Glutathion (17, 75). Die Wirkung von Bcl-2 auf zelluläres Glutathion könnte daher auch eine Erklärung für den bekannten Hemmeffekt von Bcl2 auf die MPT liefern. Über den Effekt auf die mitochondriale Atmungskette oder über die transkriptionelle Regulation zellulärer Enzyme kann Bcl-2 auf die Glutathionhomöostase rückwirken. Die mitochondriale Permeabilitätserhöhung kann aufgrund der Entkoppelung der Atmungskette dazu führen, dass Elektronen, die normalerweise zur Bildung von Wasser beitragen, stattdessen zu einer erhöhten Bildung von reaktivem Sauerstoff und zu einer Verarmung an zellulärem Glutathion führen. Durch Hemmung der mitochondrialen Permeabilitätserhöhung kann Bcl-2 möglicherweise zur Stabilisierung des zellulären GSH-Pools beitragen, wodurch der deutlich geringere Abfall des zellulären GSH bzw. der geringere Anstieg des GSSG in Bcl-2transfizierten Rat-1-Fibroblasten bei H2O2-Exposition erklärt werden könnte. Diese positive „Feedbackschleife“ (Oxidation von GSH, Öffnung der MPT-Pore, Entkoppelung der Atmungskette, Oxidation von GSH) kann möglicherweise durch die Wirkung von Bcl-2 durchbrochen werden. Die transkriptionelle Aktivität von diversen Genen wird scheinbar über das zelluläre Redox-Gleichgewicht reguliert. Viele Transkriptionsfaktoren befinden sich im Cytosol in ihrer inaktiven Form, wobei Veränderungen des zellulären Redox-Status zu ihrer Aktivierung und Translokation in den Zellkern führen können. Ein gut untersuchtes Beispiel für dieses Modell ist der Transkriptionsfaktor NF-B (85). Der Redox-Status der Zelle und die subzelluläre Kompartimentierung von GSH erlauben demnach eine differenzierte Regulation der Transkription. Auch Berichte über eine vermehrte Translokation von GSH in den Zellkern infolge Überexpression von Bcl-2 lassen 67 vermuten, dass das Bcl-2-Protein an der Modifizierung von transkriptionellen Programmen beteiligt sein kann (95). Durch transkriptionelle Regulation von Enzymen könnte Bcl-2 wiederum auf die zelluläre Glutathionhomöostase rückwirken: DNA-Chip Analysen an Bcl-2-positiven und negativen Zelllinien zeigten interessante Veränderungen bezüglich der Expression von Genen, die den intrazellulären RedoxStatus regulieren (94). So ist z. B. in Bcl-2-positiven Zelllinien die Expression der Fructose-1,6-Bisphosphatase hochreguliert. Letzteres ist ein Schlüsselenzym der Gluconeogenese und katalysiert daher indirekt die Bildung von Glucose-6-Phosphat, welches wiederum in den Pentosephosphatweg einfliesst und so zur Bildung von NADPH führt (86). NADPH wiederum trägt zur Reduktion von GSSG durch die Glutathion-Reduktase bei. Dieses Modell ist in Übereinstimmung mit der in dieser Arbeit gemachten Beobachtung, dass mit Bcl-2 transfizierte Rat-1-Fibroblasten zu einer verbesserten Bereitstellung von reduziertem Glutathion fähig sind, vor allem bei H2O2-Exposition bzw. bei erhöhtem oxidativen Stress. Ferner wurden für Bcl-2überexprimierende Zellen erhöhte NADPH-Spiegel beschrieben (23). Dieses Modell kann auch eine Erklärung dafür liefern, warum die Anwesenheit von Glucose die Effekte von Bcl-2 in dem hier untersuchten Zellschädigungsmodell nachahmen kann: Glucose führt ebenfalls zu einer vermehrten Bereitstellung von NADPH über den Pentosephosphatweg. Zur Etablierung des hier vorgeschlagenen Modells bedarf es weitergehender Untersuchungen, jedoch wird aus der vorliegenden Arbeit deutlich, dass in einem Modell der externen Induktion von oxidativem Stress das Onkoprotein Bcl-2 die intrazellulären Ca2+-Signale indirekt beeinflusst durch Erhöhung der glutahionabhängigen antioxidativen Kapazität der Zelle. Diese Beobachtungen sind vereinbar mit der ursprünglichen Hypothese von Hockenbery et al. (37), der zufolge Bcl-2 durch Regulation von antioxidativen Signalwegen apoptotische Vorgänge in der Zelle inhibiert. 68 6. Abkürzungsverzeichnis ATP Adenosintriphosphat BSA Bovines Serumalbumin BSO DL-Buthionin(S,R)-Sulfoximin cDNA Kopie-DNA (copy-DNA) CE Kapillarelektrophorese DEPC Diethylpyrocarbonat DMEM Dulbecco´s modified Eagles medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DTAB Dodecyltrimethylammoniumbromid DTT Dithiothreitol DTPA Diethyltriaminpentaessigsäure EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EOF Elektroosmotischer Fluß FCS Fötales Kälberserum GSH Glutathion (reduziert) GSSG Glutathion (oxidiert) GST Glutathion-S-Transferase HBSS Hanks gepufferte Salzlösung HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperanzinyl)ethansulfonsäure KH Krebs-Henseleit-Puffer LDH Lactat-Dehydrogenase MOPS Morpholinopropansulfonsäure NAC N-Acetylcystein NAD+ Nicotinamid-Adenindinucleotid (oxidiert) NADH Nicotinamid-Adenindinucleotid (reduziert) NADP+ Nicotinamid-Adenindinucleotidphosphat (oxidiert) NADPH Nicotinamid-Adenindinucleotidphosphat (reduziert) NC Nitro-Cellulose PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung RNA Ribonukleinsäure 69 RNase Ribonuklease S.D. Standardabweichung SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecylsulfate) SSC Citrat-gepufferte Kochsalzlösung TEMED N, N, N´,N´-Tetramethylendiamin Tris 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol Tween Polyoxyethylensorbitanmonolaurat WCE-Puffer whole cell extract-Puffer 70 7. Zusammenfassung Das Bcl-2-Protein zeigt eine protektive Wirkung gegenüber einer Vielzahl von apoptotischen Stimuli, jedoch ist der zugrundeliegende molekulare Mechanismus weitgehend unbekannt. Bei der Untersuchung der H2O2-induzierten Zellschädigung von Rat-1-Fibroblasten konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Bcl-2 vor dem Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration schützt. Dieser cytosolische Ca2+-Anstieg ist von großer Relevanz für den Zellschädigungsprozeß bei Inkubation mit H 2O2, da der Ca2+-Chelator Quin-2 den Zelltod verzögern kann. Die Überexpression von Bcl-2 resultierte in einer Veränderung des zellulären Glutathionstatus: Die Gesamtmenge an zellulärem Glutathion war um 60% erhöht und das Redoxpotential des zellulären Glutathion-Pools wurde bei Inkubation mit H2O2 in einem stärker reduzierten Zustand gehalten. Die vorliegende Arbeit zeigt eine eindeutige Ursache-Wirkungs-Beziehung zwischen dem Zusammenbruch der zellulären Glutathionhomöostase und der nachfolgenden Erhöhung der cytosolischen Ca2+-Konzentration auf. Die Stabilisierung des Glutathion-Pools durch Bcl-2, N-Acetylcystein oder Glucose verzögerte den cytosolischen Ca2+-Anstieg und den nachfolgenden Zelltod, umgekehrt führte die Depletion von Glutathion durch DL-Buthionin-(S,R)-Sulfoximin zu einem beschleunigten Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration und zu einem schnelleren Zelluntergang. Zum ersten Mal in der Literatur wird gezeigt, dass die Veränderung der Glutathionhomöostase durch Bcl-2 den entscheidenden Mechanismus darstellt, durch den Bcl-2 in dem vorliegenden Zellschädigungsmodell eine protektive Wirkung ausübt. Die Wirkung von Bcl-2 auf cytosolisches Ca2+ ist sekundär, weil der Schutzeffekt durch die Veränderung des zellulären Glutathions vollständig erklärt werden kann. 71 8. Literaturverzeichnis 1. Adams, J. M., and S. Cory. (1998). The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Science 281:1322-6. Amundson, S. A., T. G. Myers, and A. J. Fornace, Jr. (1998). Roles for p53 in growth arrest and apoptosis: putting on the brakes after genotoxic stress. Oncogene 17:3287-99. Armitage, P. 1971. Statistic methods in medical research. Blackwell Scientific Publications, Oxford. Armstrong, J. S., and D. P. Jones. (2002). Glutathione depletion enforces the mitochondrial permeability transition and causes cell death in Bcl-2 overexpressing HL60 cells. 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Rauen danke ich besonders für die exzellente wissenschaftliche Betreuung und Förderung bei der Erstellung dieser Dissertation sowie ihre unermüdliche Diskussionsbereitschaft. Herrn Prof. Dr. Tarik Möröy, Herrn Dr. Thorsten Schmidt und Herrn Dr. Holger Karsunky vom Institut für Zellbiologie danke ich für die Bereitstellung der Zelllinien, die engagierte Unterstützung bei der Durchführung der molekularbiologischen Untersuchungen sowie die kritischen Kommentare bei der Erstellung dieser Dissertationsschrift. Allen Mitgliedern des Institutes für Physiologische Chemie und des Institutes für Zellbiologie danke ich für die gute Zusammenarbeit. 78
